发酵乳杆菌的生长限制性因素分析及高密度培养工艺优化

孙媛媛，崔树茂，唐鑫，毛丙永，赵建新，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

发酵乳杆菌不仅是传统发酵食品中的优势微生物，且广泛地存在于人体肠道。2009年，它被列入了欧洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)的合格安全性推定(Qualified Presumption of Safety, QPS)清单，并被美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration, FDA)列为“公认的安全”(generally recognized as safe, GRAS)生物。在2011年被中国卫计委列入《可用于食品的菌种名单》[1]。近年来，发酵乳杆菌的功能特性不断被挖掘出来，如耐酸耐胆盐[2]、降解胆固醇[3]、抗氧化[2]、抑菌[4-5]等，并且有多株功能性发酵乳杆菌被开发上市[6]。

发酵乳杆菌是专性异型发酵乳杆菌，在生长过程中消耗糖产生乳酸、乙酸和CO2，底物的利用效率及产物抑制可能均不同于同型发酵乳杆菌和双歧杆菌。乳酸菌在生长过程中首先受到底物抑制，碳源、氮源、无机盐、微量元素都是组成菌体增殖底物的关键内容，其中，碳源和氮源能够为菌株提供生长所需的营养物质，无机盐除了提供矿质元素外，还作为缓冲体系防止发酵液pH下降过快，微量元素作为多种酶的辅助因子参与菌株的代谢[7]。丰富的底物是菌株生长的必要条件，但是底物浓度过高会使培养基的初始渗透压过高，反而会抑制菌株的生长，因此乳酸菌培养前底物浓度过高、底物成分比例不合适及培养后期限制性底物的不足与消耗均是菌株生长的抑制因素[8]。众所周知，有机酸积累引起的酸抑制是乳酸菌分批培养时抑制菌体生长的主要因素，但是通过补碱的恒pH培养可以轻松解除酸抑制[9]。已有研究表明，中性条件下酸根积累引起的渗透压升高成为大部分同型发酵乳杆菌和双歧杆菌在恒pH培养时的主要抑制因素[8]。发酵乳杆菌代谢产生的乳酸和乙酸对菌体的抑制是否亦是渗透压抑制还是有酸根毒害作用需进一步研究，且在菌株培养时需均衡底物和代谢产物浓度，既确保底物浓度不会对菌株产生抑制，又需保证底物能够为菌体高浓度增殖提供充足营养。

本文在分析底物抑制和代谢产物抑制的基础上，基于底物浓度、渗透压及最适pH优化发酵乳杆菌的恒pH培养工艺，达到高密度培养的目的，为工业化生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

发酵乳杆菌FXJCJ6-1分离自新疆昌吉的一位回民的粪便样品，发酵乳杆菌FGDLZR161分离自广东连州的一位儿童的粪便样品，发酵乳杆菌CCFM422分离自海南省乐东黎族自治县的酸豆角样品，均由江南大学食品生物技术中心保藏。

1.1.2 试剂

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Tween 80、NaCl、乳酸钠水溶液，国药集团化学试剂有限公司；酵母蛋白FM103、酵母浸粉FM803、酵母浸粉FM528、大豆蛋白胨FP410、牛骨蛋白胨FP326、鱼骨蛋白胨FP351，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C1115B型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；FE20型pH计、EL3002型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；MS 3 basic 型涡旋振荡器，德国IKA公司；MLS-3750型高温高压灭菌锅，日本SANYO公司；T&J-Minipod 1L×8型迷你平行发酵罐，迪必尔生物工程有限公司；löser-om806 m型冰点渗透压测定仪，德国löser公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

MRS液体培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、乙酸钠2、K2HPO42、柠檬酸氢二铵2、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，调节pH 6.2～6.4。

MRS固体培养基：与MRS液体培养基配方相同，另加20 g/L的琼脂粉。

氮源偏好分析培养基[10](g/L)：氮源1、葡萄糖6、K2HPO410、Na2HPO410、MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，调节pH 6.0。

MRS氮源偏好分析培养基(g/L)：氮源1(0.4胰蛋白胨、0.4牛肉膏、0.2酵母粉)，其他成分同氮源偏好分析培养基。

MRS氮源(MRS无机盐)培养基(g/L)：氮源1(0.4胰蛋白胨、0.4牛肉膏、0.2酵母粉)、葡萄糖6、乙酸钠2、K2HPO42、柠檬酸氢二铵2、MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05、Tween 80 1 mL，调节pH 6.0。上述培养基均在115 ℃灭菌20 min。

1.3.2 菌株活化与培养

用接种环从保菌管中蘸取少量菌液，在MRS固体培养基上划线，平板置于37 ℃培养24～36 h。挑取单菌落，接入5 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h。以体积分数为4%的接种量将培养液接种到新鲜的MRS液体培养基中，培养12 h后得到活化的种子液。以下实验方法中的接种量均为4%。

1.3.3 菌株对不同氮源利用的偏好性分析

按照1.3.1的方法配制不同的氮源培养基，接入菌株后37 ℃培养至稳定期，测定OD600。

1.3.4 生长限制性无机盐分析

用NaCl代替MRS培养基中的无机盐，保持2种培养基的渗透压相同，在发酵罐中接入菌株，37 ℃恒pH 6.0培养至稳定期，每2 h取样，绘制菌株的生长曲线，同时在稳定期取样，测定活菌数。

1.3.5 生长限制性微量元素分析

培养基配方(g/L)：氮源1、葡萄糖6、K2HPO410、Na2HPO410、Tween 80 1 mL。培养基中只添加单一的微量元素(0.05 MnSO4、0.05 MgSO4),质量比1∶1添加MnSO4和MgSO4，空白组(两者都不加)，37 ℃培养至稳定期，测定OD600。

1.3.6 中性条件下酸根的最低抑菌浓度测定

参照崔树茂[8]的方法，在MRS液体培养基中添加乳酸钠、乙酸钠和NaCl，配成0.1、0.2、…、1.5 mol/L的盐溶液，在无菌环境中用NaOH或HCl将溶液pH值调节至7.0。接入菌株后测定初始OD600，然后在37 ℃培养24 h，测定OD600，若OD600未发生变化，说明菌株被完全抑制，此样品的盐浓度为该菌株的最低抑菌浓度。

1.3.7 最适生长渗透压及完全抑制渗透压的测定

添加3 g/L的NaCl会使培养基的渗透压平均增加100 mOsm/kg，而MRS液体培养基的渗透压一般在350 mOsm/kg左右，计算NaCl的添加量，配制350、400、500、…、3 300 mOsm/kg的培养基，接入菌株后37 ℃培养，每2 h取样测定OD600，绘制菌株的耐渗透压曲线，计算菌株的代时。

1.3.8 碳氮消耗比测定

按照1.3.1氮源偏好分析培养基的配方，其中的氮源为各菌株的最适氮源。在菌株发酵过程中不断监测OD600和发酵液中的葡萄糖浓度，计算生长速率被抑制时的碳氮消耗比。

1.3.9 生长限制性微量元素最适浓度的测定

利用恒pH自动反馈补糖培养分析微量元素的质量浓度及比例对活菌数的影响。培养基中分别称取0.05、0.15、…、0.55 g/L的MnSO4和MgSO4，m(MnSO4)∶m(MgSO4)=1∶1，以相同的培养基和培养条件置于平行发酵罐，接入菌株后37 ℃恒pH 6.0补糖培养至稳定期，测定OD600和活菌数，优选出最佳质量浓度。然后在最佳质量浓度的基础上，改变两者的比例，重复上述操作，优选出微量元素之间的最佳比例。

1.3.10 最适生长pH的测定

设置不同的pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5，接入菌株后37 ℃培养至稳定期，测定OD600及活菌数。

1.3.11 恒pH分批培养

根据培养基的底物分析，确定最优的底物质量浓度，根据耐渗透压曲线和碳氮消耗比，计算培养基中的碳源、氮源的添加量，培养基的初始渗透压应低于菌株生长速率被抑制时的渗透压。在发酵罐中恒最适pH发酵，37 ℃培养至稳定期，测定OD600及活菌数。

1.3.12 恒pH自动反馈补糖培养

推算恒pH培养时菌体被完全抑制时消耗的最适氮源添加量，根据底物分析，配制渗透压为350 mOsm/kg左右的培养基，在发酵罐中以最适pH进行37 ℃恒pH补糖培养，补料液为400 g/L的葡萄糖溶液，稳定期测定OD600及活菌数。具体操作如下：

配制400 g/L(c碱)的NaOH溶液和400 g/L(c糖)的葡萄糖溶液，开启发酵罐的补糖和补碱系统，关联比例(k)根据公式(1)[8]设置：

(1)

式中：40，NaOH的摩尔分子量，g/mol；W，菌株代谢单位质量的葡萄糖产生的酸摩尔数，mol/g。

1.3.13 测定方法

菌体密度的测定：用紫外分光光度计在波长600 nm下测定发酵液的吸光度值，若吸光度值超过0.8，需要将菌液稀释，使稀释后菌液的吸光度值在0.2～0.8；活菌数的测定：平板菌落计数法；葡萄糖浓度的测定：葡萄糖试剂盒测定；渗透压的测定：渗透压仪测定。

1.4 数据统计分析

所有实验均重复3次，实验结果表示为平均值±标准偏差。实验数据采用Origin 9.1绘图，采用SPSS 25.0统计软件进行单因素ANOVA判断(邓肯检验)，P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 限制性底物的分析和优化

2.1.1 氮源利用的偏好性

乳酸菌利用葡萄糖发酵的效率高，可以直接利用葡萄糖进行生长代谢所需的一系列生化反应[11]。另外葡萄糖价格低廉，综合考虑后，选择葡萄糖作为发酵乳杆菌的最佳碳源。

氮源作为生长底物的一种，对乳酸菌的生长起着重要的作用。由于乳酸菌中存在着不同的蛋白水解酶系，因此不同的乳酸菌利用的最适氮源不同[12]。按照1.3.3的方法，系统研究单位质量(1 g)不同氮源对发酵乳杆菌的增殖效果，以此归纳出发酵乳杆菌对氮源利用的偏好性。

从表1可以看出，3株发酵乳杆菌在复合氮源(酵母浸粉528+牛骨蛋白胨+牛骨蛋白胨)培养基中的OD600与在其他单一氮源培养基中的OD600有显著性差异(P<0.05)，说明发酵乳杆菌对复合氮源的利用程度较高。这与SAFARI等[13]的研究结果一致，他们发现复合氮源更有利于嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌等乳酸菌的生长。

除此之外，比较MRS氮源组和MRS氮源(MRS无机盐)组，可以发现MRS氮源(MRS无机盐)组的OD600明显高于MRS氮源组，说明培养体系中无机盐对发酵乳杆菌的增殖效果有影响，即无机盐有可能是发酵乳杆菌的生长限制性因素。

另外，朱丹凤等[14]研究发现，上述氮源中的氨基酸种类和含量丰富，所以排除了由于氮源中缺少必需氨基酸而影响菌株增殖的可能。从单一氮源来看，发酵乳杆菌对微生物类氮源的利用程度较高，这是因为这类氮源的肽相对分子质量90%都集中在500 Da以下(表2)，说明发酵乳杆菌对小分子肽具有偏好性。但是将不同种类、不同分子质量的氮源复配后，发酵乳杆菌的利用程度更高，说明单一氮源中缺乏生长因子，而复配后的氮源中富含生长因子，从而促进了菌株的生长。综上，酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源，这个结论可以为发酵乳杆菌工业化生产提供一定的指导。

2.1.2 生长限制性无机盐

无机盐一般是作为缓冲盐被加入到培养基中，其能够在菌体增殖时减缓发酵液pH值下降的速率，同时维持发酵环境的渗透压。姚国强等[15]研究发现，LactobacillusreuteriIMAU10240在缺乏无机盐的培养基中生长时，其生长速率明显受到抑制。但是大部分乳酸菌在恒pH条件下生长时，其增殖情况并不受无机盐存在与否的影响。本实验通过对比发酵乳杆菌在2种培养基(添加无机盐、未添加无机盐)中的生长情况，探究在恒pH培养时，无机盐对发酵乳杆菌的生长是否有促进作用。

表2 不同氮源的肽分布 单位：%

由2.1.1的结果可知，分批培养时，添加的无机盐种类对发酵乳杆菌的增殖有一定的影响。但是，由图1可知，在恒pH培养时，3株发酵乳杆菌在2种培养基中的生长情况大致相同，且稳定期的活菌数也不存在显著性差异(P>0.05)。由此可以得知，在恒pH培养时，缓冲盐的作用是维持发酵液pH的相对稳定，无机盐的添加并不会对发酵乳杆菌的增殖起到促进作用。

a-发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b-发酵乳杆菌FGDLZR161;c-发酵乳杆菌CCFM422图1 发酵乳杆菌未添加和添加无机盐恒pH培养的生长曲线及活菌数Fig.1 Growth curve and viable counts of L.fermentum cultured at constant pH with inorganic salts and or no inorganic salts注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05),相同代表差异不显著(下同)

2.1.3 生长限制性微量元素分析

微量元素是一类对微生物的生长有促进作用，但需要量极少的元素，通常是作为某些活性物质的组成成分或者酶的激活剂发挥作用[16]。在异型乳酸发酵中，Mn2+、Mg2+是多个关键酶的辅酶因子。Mg2+参与核蛋白体的聚合[17]，适量的Mg2+能促进ATP的合成[18]。另外，李兴峰[19]研究发现，Mn2+、Mg2+对乳酸脱氢酶的酶活有促进作用。CHENG等[20]研究发现，Mn2+在植物乳杆菌中充当了“代谢转换”的作用，它调节了丙酮酸到乳酸等代谢途径的代谢通量。因此，一般在发酵培养基中都会添加MnSO4和MgSO4来促进乳酸菌的生长。

由图2可知，Mn2+和Mg2+对3株发酵乳杆菌的生长具有促进作用，发酵乳杆菌在Mn2+和Mg2+均添加的情况下生长效果明显优于只添加单一微量元素的组别和空白组，具有显著性差异(P<0.05)。因此，可以判定Mn2+和Mg2+是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素。

a-发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b-发酵乳杆菌FGDLZR161;c-发酵乳杆菌CCFM422图2 发酵乳杆菌限制性微量元素分析结果Fig.2 Analysis results of limiting trace elements of L.fermentum

2.2 代谢产物的抑制

2.2.1 酸根积累对菌株的抑制作用

按照1.3.6的方法，研究pH 7.0条件下未解离的酸根对发酵乳杆菌的抑制，判断酸根是否是发酵乳杆菌生长的主要限制性因素。测定了pH 7.0条件下NaCl、乙酸钠和乳酸钠对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度。NaCl对菌株的抑制主要是渗透压抑制，因此将NaCl的最低抑菌浓度作为研究酸根抑制的对照。若乙酸钠和乳酸钠的最低抑菌浓度低于NaCl的最低抑菌浓度，则表明酸根对发酵乳杆菌具有特异性毒害作用。

由表3可知，NaCl、乙酸钠和乳酸钠在pH 7.0条件下对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度均相同，说明pH 7.0时，乙酸根和乳酸根对这3株发酵乳杆菌的抑制是由于酸根积累引起的渗透压升高，即，未解离的酸根并不会对发酵乳杆菌有特异性毒害作用，发酵乳杆菌的生长主要是受到渗透压的抑制。

表3 NaCl、乙酸钠和乳酸钠在pH 7.0时对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度 单位：mmol/L

2.2.2 最适生长渗透压与完全抑制渗透压

由2.2.1的结果可知，发酵乳杆菌生长的主要抑制因素是酸根积累引起的渗透压升高，因此，需要重点研究每株菌对环境渗透压的耐受程度，以此更好地优化菌株的培养工艺。

由图3可知，发酵乳杆菌FXJCJ6-1和FGDLZR161在渗透压为1 000 mOsm/kg时生长速率被抑制，发酵乳杆菌CCFM422在渗透压为1 200 mOsm/kg时生长速率被抑制。

2.3 培养工艺的优化

2.3.1 底物浓度的优化

2.3.1.1 碳氮比

基于2.1.1最适氮源的结果，按照1.3.8的方法，测定发酵乳杆菌利用最佳氮源生长速率被抑制和完全被抑制时的葡萄糖浓度，结果如表4所示。

表4 发酵乳杆菌生长速率被抑制和完全被抑制时的碳氮消耗比Table 4 Ratio of carbon and nitrogen consumption when the growth rate of L.fermentum was suppressed and completely suppressed

DISHISHA等[21]研究发现，培养基中碳源和氮源比例过低时，菌体代谢旺盛产生大量的代谢废物，从而抑制菌体增殖；碳源和氮源比例过高时，菌体主要利用营养物质来合成积累代谢产物。王玉林等[22]研究发现，培养基的最适碳氮比为生长速率被抑制时的消耗比时，菌株的增殖效率最高。由表4可知，发酵乳杆菌FXJCJ6-1和CCFM422的最佳碳氮比为2.7，发酵乳杆菌FGDLZR161的最佳碳氮比为2.8。基于菌株生长速率被抑制时的碳氮比结果及渗透压值，最大程度地提高培养基中的碳、氮含量，以此提高菌株的发酵密度。

2.3.1.2 限制性微量元素浓度及比例的优化

由2.1.3的结果可知，Mn2+和Mg2+均是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素，因此，探究Mn2+、Mg2+质量浓度及比例与活菌数之间的关系。

a、c、e-发酵乳杆菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422的耐渗透压曲线;b、d、f-发酵乳杆菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422不同渗透压下的代时图3 发酵乳杆菌的耐渗透压曲线及不同渗透压下的代时Fig.3 The osmotic pressure curve of L.fermentum and the generation time under different osmotic pressure conditions

由图4-a、4-c、4-e可知，确定m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1时，Mg2+和Mn2+的总质量浓度越高，活菌数越高，但增加到一定程度后，活菌数的变化差异不大，说明一定范围内提高Mg2+和Mn2+的质量浓度，可以提高菌体的增殖效果。这与PHAM等[23]的研究结果一致，他们发现Mn2+质量浓度过高时会抑制α-葡萄糖苷酶等水解酶，对菌体增殖造成负面影响。

在Mg2+、Mn2+的最适质量浓度的基础上改变Mg2+和Mn2+的比例，由图4-b、4-f可知，m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1时，发酵乳杆菌FXJCJ6-1和CCFM422的活菌数与其他组有显著性差异(P<0.05)；而图4-d表明Mg2+和Mn2+的质量比对发酵乳杆菌FGDLZR161的影响不是很大。

综上，培养发酵乳杆菌FXJCJ6-1的微量元素为m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1，总质量浓度为0.35 g/L；培养发酵乳杆菌FGDLZR161的微量元素为m(Mg2+)∶m(Mn2+)=3∶1，总质量浓度为0.35 g/L；培养发酵乳杆菌CCFM422的微量元素为m(Mg2+)∶m(Mn2+)=1∶1，总质量浓度为0.45 g/L。

2.3.2 最适生长pH

乳酸菌的最适生长pH值一般在5.0～7.0，不同乳酸菌的最适生长pH不同。乳酸菌在发酵过程中会产生有机酸，从而使发酵液pH低于正常生长pH范围，导致菌株的细胞膜渗透性和细胞内酶活性受到干扰[24]。在确定了最优培养基的基础上，设置不同的pH梯度，探究3株发酵乳杆菌的最适生长pH。

从图5可以看出，发酵乳杆菌FXJCJ6-1的最适pH值为6.0，发酵乳杆菌FGDLZR161和CCFM422的最适pH值为5.5。

a、b-发酵乳杆菌FXJCJ6-1 Mg2+、Mn2+的浓度和比例优化结果;c、d-发酵乳杆菌FGDLZR161 Mg2+、Mn2+的浓度和比例优化结果;e、f-发酵乳杆菌CCFM422 Mg2+、Mn2+的浓度和比例优化结果图4 发酵乳杆菌限制性微量元素质量浓度及比例优化Fig.4 Optimization results of the mass concentration and proportion of limiting trace elements in L.fermentum

图5 发酵乳杆菌的生长pH优化结果Fig.5 Optimization results of growth pH of L.fermentum

2.3.3 恒pH分批培养

恒pH分批培养，是将底物一次性加到发酵罐中恒pH培养。根据上述的限制性底物分析结果以及耐渗透压曲线和碳氮消耗比，确定培养基中的碳源、氮源、微量元素的添加量，需要注意的是培养基的初始渗透压应低于菌株生长速率被抑制时的渗透压。

(1)发酵乳杆菌FXJCJ6-1恒pH分批培养

由表5可知，培养基初始渗透压接近于生长速率被抑制的渗透压时，发酵液中的活菌数最大。因此，发酵乳杆菌FXJCJ6-1恒pH分批培养的最佳培养基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉528 8、牛骨蛋白胨 16、鱼骨蛋白胨 16)，葡萄糖 108，MgSO40.175，MnSO40.175，Tween 80 1 mL，恒pH 6.0培养，活菌数为(1.3±0.1)×1010CFU/mL，较在MRS静置培养时的活菌数(3.2±0.07)×109CFU/mL，提高了3.1倍。

(2)发酵乳杆菌FGDLZR161恒pH分批培养

由表6可知，培养基初始渗透压接近于生长速率被抑制的渗透压时，发酵液中的活菌数最大。因此，发酵乳杆菌FGDLZR161恒pH分批培养的最佳培养基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉528 8、牛骨蛋白胨 16、鱼骨蛋白胨 16)，葡萄糖 112，MgSO40.26，MnSO40.09，Tween 80 1 mL，恒pH 5.5培养，活菌数为(1.1±0.1)×1010CFU/mL，较在MRS静置培养时的活菌数(2.3±0.03)×109CFU/mL，提高了3.8倍。

表5 发酵乳杆菌FXJCJ6-1的恒pH分批培养的培养基及培养结果Table 5 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FXJCJ6-1

表6 发酵乳杆菌FGDLZR161的恒pH分批培养的培养基及培养结果Table 6 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FGDLZR161

(3)发酵乳杆菌CCFM422恒pH分批培养

由表7可知，氮源40和45 g/L条件下活菌数差异不大，考虑成本问题，选择40 g/L的氮源进行培养。因此，确定发酵乳杆菌CCFM422恒pH分批培养的最佳培养基配方(g/L)：氮源40(酵母浸粉 528 8、牛骨蛋白胨 16、鱼骨蛋白胨 16)，葡萄糖 108，MgSO40.225，MnSO40.225，Tween 80 1 mL，恒pH 5.5培养，活菌数为(9.5±0.5)×109CFU/mL，较在MRS静置培养时的活菌数(1.7±0.07)×109CFU/mL，提高了4.6倍。

表7 发酵乳杆菌CCFM422的恒pH分批培养的培养基及培养结果Table 7 Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum CCFM422

2.3.4 恒pH自动反馈补糖培养

恒pH自动反馈补糖培养是基于较低的渗透压条件，后期根据底物消耗自动补料，这种培养模式避免了高浓度底物引起的限制，可以最大程度地减缓发酵液渗透压的升高，对耐渗透压能力较弱菌株的增殖效果较好。结果如图6所示。

a-发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b-发酵乳杆菌FGDLZR161;c-发酵乳杆菌CCFM422图6 发酵乳杆菌恒pH分批培养和自动反馈补糖培养结果Fig.6 Constant pH automatic feedback sugar supplement results of L.fermentum

恒pH自动反馈补糖培养时，发酵乳杆菌FXJCJ6-1、FGDLZR161、CCFM422稳定期活菌数分别为(6.8±0.1)×109、(7.9±0.9)×109和(7.1±0.2)×109CFU/mL。由于发酵乳杆菌能够耐受较高的渗透压，所以恒pH自动反馈补糖培养的低渗优势没有得到很好的体现。因此选择恒pH分批培养来增殖发酵乳杆菌。

3 结论

(1)发酵乳杆菌对不同种类的氮源利用偏好性不同，酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源。

(2)无机盐只是起到减缓发酵液pH降低速率的作用，在恒pH培养发酵乳杆菌时，添加无机盐并不能提高菌株的增殖效果。

(3)Mn2+和Mg2+均是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素，菌体的高效增殖需要两者同时存在。

(4)中性条件下，酸根积累并不会对发酵乳杆菌有特异性毒害作用，发酵乳杆菌的生长主要是受到渗透压的抑制，且发酵乳杆菌能够耐受较高的渗透压环境。

(5)恒pH分批培养是发酵乳杆菌的最优培养工艺。恒pH分批培养发酵乳杆菌时，初始底物浓度应基于菌株的耐渗透压曲线进行设定，培养基的初始渗透压应接近于菌株生长速率被抑制时的渗透压，而培养基中的碳氮源添加比例应按照菌株生长速率被抑制时的碳氮消耗比进行设定。