基于UPLC Orbitrap MS/MS分析锦灯笼中化学成分

杨 迪，李方彤，刘 明，宋凤媛，葛 岩， 戴雨霖，郑 飞，越 皓

(长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117)

锦灯笼为茄科植物酸浆PhysalisalkekengiL.var.franchetii(Mast.)Makino的干燥宿萼或带果实的宿萼，始载于《神农本草经》，味苦、性寒、归肺经，具有清热毒、利咽喉、通二便之功效[1]。锦灯笼作为药食同源的中药材，具有广泛的应用价值。中医临床多用来治疗肺热咳嗽、咽喉肿痛、痢疾、水肿、小便淋漓、大便不通、丹毒、黄水疮等病症。现代药理学研究表明，锦灯笼具有利尿、强心、镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂及降血糖等多种药理活性[2]，其主要活性成分为甾体类(酸浆苦素A、B等)、甾醇类(酸浆甾醇A、B)、黄酮类(槲皮素、木犀草素-4-O-β-D-葡葡萄糖苷等)、生物碱类(红古豆碱、托品碱)以及有机酸(咖啡酸、琥珀酸等)化合物。舒尊鹏等[3]从锦灯笼中分离并鉴定得到木质素类、黄酮类、简单苯丙素类共8种化合物；Huang等[4]利用UHPLC-QTOF-MS/MS技术在负离子模式下分析了酸浆苦素类化合物的裂解规律，并从锦灯笼的宿萼中鉴定出46种酸浆苦素类化合物；吴爽等[5]采用HPLC-MS/MS法提取分析锦灯笼宿萼与果实中的石油醚部位，共鉴别出16种化学成分，发现宿萼和果实的化学成分主要为氨基酸、生物碱和黄酮类化合物。Sun等[6]研究表明，锦灯笼乙酸乙酯层化合物对大鼠有延缓衰老的作用；Hu等[7]采用HPLC-ESI-QTOF-MS法分析锦灯笼的乙酸乙酯提取物，发现主要有效成分为黄酮类、类黄酮和酚酸化合物。

目前，色谱-质谱联用技术已广泛应用于中药材活性成分的分析与鉴定，但是利用液相色谱-质谱法分析锦灯笼中化学成分的报道却较少[8]。超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC Orbitrap HRMS)法具有分离度高、灵敏度高、选择性强等特点，对样品分析更准确。本研究拟采用该方法分析锦灯笼提取物中化学成分，希望为锦灯笼的物质基础研究和类似化合物的质谱裂解途径研究提供方法参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器

UltiMate 3000 series高效液相色谱仪、Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品；超纯水系统：德国Milli-Q公司产品。

1.2 主要材料与试剂

芦丁、槲皮素、木犀草苷、芹菜素、木犀草素、异槲皮苷、柠檬酸、琥珀酸、3-咖啡酰基奎宁酸、咖啡酸、对香豆酸、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、酸浆苦素A、酸浆苦素O、酸浆苦素L、酸浆苦素N对照品：纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司产品；锦灯笼：吉林省仙草医药药材有限公司产品，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为茄科植物酸浆PhysalisalkengiL.var.franchetii(Mast.)Makino的干燥果实和宿萼。

甲醇、乙腈、甲酸：均为色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；超纯水：由德国Milli-Q超纯水系统制备。

1.3 实验方法

1.3.1样品的制备 将锦灯笼带果实的宿萼粉碎，用80%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，于80 ℃水浴锅挥干，加甲醇溶解，用甲醇稀释成0.01 g/L溶液，过0.22 μm微孔滤膜，得样品溶液，备用。

1.3.2色谱条件 Thermo Scientific Syncronis C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；洗脱条件：0～10 min(20%B)，10～30 min(20%～25%B)，30～45 min(25%～35%B)，45～55 min(35%～40%B)，55～70 min(40%～70%B)，70～80 min(70%～20%B)；流速0.2 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃。

1.3.3质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式扫描，喷雾电压2.5 kV，毛细管温度320 ℃，透镜电压50 eV，鞘气压力2.76×105Pa，辅助气压力6.89×104Pa，辅助气温度300 ℃，分辨率70 000，质量扫描范围m/z50～1 500。

2 结果与讨论

2.1 锦灯笼样品中化学成分的分析

采用UPLC Orbitrap HRMS法分析鉴定锦灯笼样品中化合物，分别采用正、负离子模式扫描样品，在负离子模式下，锦灯笼提取物中化合物的响应值较高、噪音较小，因此将负离子模式作为主要检测方式。结合文献[7]报道、对照品和二级质谱裂解碎片的离子信息，共分析鉴定出23种化合物，其总离子流图示于图1，相关数据列于表1。

图1 负离子模式下，锦灯笼样品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Physalis Calyx seu Fructus sample at negative ion mode

2.2 有机酸类化合物的结构鉴定

在锦灯笼样品中共鉴定出5种有机酸类化合物，此类化合物在质谱中多以[M-H]-准分子离子的形式存在，MS2扫描过程中易产生[M-H-H2O]-或[M-H-CO2]-中性丢失的碎片离子。经推测，化合物1、2、3、4、5均为有机酸。以化合物5为例，在ESI-模式下，得到m/z163.038 7 [M-H]-准分子离子峰，以此为母离子进行二级质谱分析，脱去1分子CO2，得到m/z119.048 7 [M-H-CO2]-。通过与对照品对比保留时间和碎片离子，鉴定化合物5为对香豆酸，其裂解途径示于图2。通过与文献[8]比对，鉴定化合物1、2、3、4分别为柠檬酸、琥珀酸、3-咖啡酰基奎宁酸、咖啡酸。

2.3 黄酮类化合物的结构鉴定

在锦灯笼样品中共鉴定出12种黄酮及其衍生物，其中包括5种黄酮类、5种黄酮醇类、1种二氢黄酮醇类和1种花青素类化合物。

黄酮类化合物的质谱特征较强，易产生甲基、羧基、糖苷等碎片离子峰。经推测，化合物8、10、11、14、17均为黄酮类化合物，裂解规律相似。以化合物17为例，在ESI-模式下，得到m/z269.045 0 [M-H]-准分子离子峰，黄酮母核C环1,4位RDA裂解开环得到碎片离子m/z151.002 2 [M-H-C8H6O]-，继而脱去1分子CO2得到m/z107.012 3 [M-H-C8H6O-CO2]-碎片离子。该化合物的分子式为C15H10O5，经与对照品比对，鉴定化合物17为芹菜素，裂解规律示于图3。同理分析，化合物10为芹菜素-7-O-葡萄糖苷，化合物14为木犀草素。在ESI-模式下，化合物8与11有相同的准分子离子峰m/z447.092 1 [M-H]-，二级质谱图中显示相同的碎片离子m/z285.039 8[M-H-Glc]-、151.002 2 [M-H-Glc-C8H6O2]-、133.028 0 [M-H-Glc-C8H6O2-H2O]-、107.012 3 [M-H-Glc-C8H6O2-CO2]-，由高分辨质谱数据可知二者的分子式均为C21H20O11，表明二者互为同分异构体。根据对照品信息及相关文献[9]报道，鉴定化合物8为木犀草苷，化合物11为木犀草素-4-O-β-D-葡萄糖苷。

图2 对香豆酸的裂解途径Fig.2 Fragmentation pathway of p-hydroxycinnamic acid

图3 黄酮类化合物的裂解途径Fig.3 Fragmentation pathway of flavonoid

图4 山奈甲黄素-3-O-葡萄糖苷的裂解途径Fig.4 Fragmentation pathway of kaempferide-3-O-glucoside

黄酮醇类化合物的结构特点是在黄酮基本母核的3位上连有羟基或其他含氧基团。经推测，化合物6、9、15、19为黄酮醇类化合物。以化合物6为例，在ESI-模式下，得到m/z609.144 9 [M-H]-准分子离子峰，脱去1分子葡萄糖和1分子鼠李糖形成黄酮类特征母核碎片离子m/z301.037 9 [M-H-Glc-Rha]-，m/z301.026 9失去1个中性碎片H2CO生成m/z271.024 5 [M-H-Glc-Rha-H2CO]-，m/z151.003 5 [M-H-Glc-Rha-H2CO-C8H6O3]-为黄酮母核C环1,4位发生RDA裂解生成。该化合物的分子式为C27H30O16，结合文献[10]，并与对照品的保留时间、二级碎片离子信息进行比对，鉴定化合物6为芦丁。依据裂解规律[11]，鉴定化合物9、15、19分别为异槲皮苷、槲皮素、山奈素。化合物12在ESI-模式下得到m/z461.107 8 [M-H]-准分子离子峰，二级质谱中丢失1分子葡萄糖基形成m/z298.047 3[M-H-Glc]-碎片离子，然后发生特征丢失CH3·自由基形成m/z283.024 1 [M-H-Glc-CH3]-碎片离子，继而中性丢失脱去CO生成m/z255.029 1 [M-H-Glc-CH3-CO]-碎片离子。该化合物的分子式为C22H22O11，鉴定化合物12为山奈甲黄素-3-O-葡萄糖苷。该化合物在锦灯笼中首次被发现，其裂解途径示于图4。

二氢黄酮醇类化合物具有黄酮醇类2,3位被氢化的基本母核。化合物7在ESI-模式下得到m/z449.107 8 [M-H]-准分子离子峰，以其为母离子进行二级质谱分析，得到m/z287.055 4 [M-H-Glc]-碎片离子，即母离子失去1分子葡萄糖。该化合物的分子式为C21H22O11，根据文献[12]报道，鉴定其为二氢山奈酚-7-O-葡萄糖苷。

花色素类化合物的结构特点是基本母核的C环无羰基，具有2-苯基-苯并吡喃阳离子结构。化合物16在ESI-模式下得到m/z491.118 6 [M-H]-准分子离子峰，二级质谱中母离子失去1分子葡萄糖基生成m/z329.065 8 [M-H-Glc]-碎片离子，m/z148.387 9 [M-H-Glc-C9H9O4]-为花青素C环发生0/2位C-C键断裂产生的0,2A+·自由基离子。化合物16的分子式为C23H24O12，根据对照品信息及文献[13]报道，鉴定其为锦葵色素-3-O-葡萄糖苷，该化合物在锦灯笼中首次被发现，其二级质谱图示于图5。

图5 锦葵色素-3-O-葡萄糖苷的二级质谱图Fig.5 MS/MS spectrum of malvidin-3-O-glucoside

2.4 酸浆苦素类化合物的结构鉴定

酸浆苦素类化合物的基本结构为13,14～16,24-环麦角甾烷。在ESI-模式下，酸浆苦素类化合物的主要裂解方式为：1) 脱水，丢失CO、CO2产生[M-H-H2O]-、[M-H-2H2O]-、[M-H-H2O-CO]-、[M-H-H2O-2CO2]-等碎片离子；2) B环开环裂解产生m/z149、71/73，C环开环裂解产生m/z193、71/73等碎片离子。化合物13、18、20、21、22、23为酸浆苦素类化合物。

以化合物13为例，在ESI-模式下得到m/z543.186 0 [M-H]-准分子离子峰，二级质谱中出现m/z525.175 0 [M-H-H2O]-、515.190 6 [M-H-CO]-、499.196 6 [M-H-CO2]-、481.185 5 [M-H-H2O-CO2]-、481.185 4 [M-H-H2O-CO2]-、193.085 7 [M-H-C17H18O8]-、135.043 6 [M-H-C17H18O8-H2O-C3H4]-、71.012 3 [M-H-C25H28O9]-等碎片离子，其中特征碎片离子m/z193.085 7、135.043 6是由A部分环裂产生的，m/z71.012 3是由B部分产生的。该化合物的分子式为C28H32O11，与文献[14-15]比较，推断该化合物为酸浆苦素D。通过与对照品对比保留时间、二级碎片离子信息，鉴定化合物18、21、22、23分别为酸浆苦素A、酸浆苦素O、酸浆苦素L、酸浆苦素N。化合物20与酸浆苦素A的MS/MS碎片离子相同，推测二者互为同分异构体，根据出峰时间与文献[4]比较，推测化合物20为7-β-羟基酸浆苦素A。酸浆苦素类化合物的裂解规律示于图6。

3 结论

本研究采用UPLC Orbitrap HRMS法分析了锦灯笼果实和宿萼提取物中的化学成分，根据所获得的精确分子质量、准分子离子和碎片离子等信息，并结合对照品信息和相关文献，共鉴定出23种化学成分，包括5种有机酸、12种黄酮类、6种酸浆苦素类化合物，其中山奈甲黄素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷为首次在锦灯笼中发现，同时分析了各化合物的裂解规律。

图6 酸浆苦素A,D,L,N,O的裂解途径Fig.6 Fragmentation pathways of physalin A, D, L, N, O