核桃多糖研究进展

荣瑞芬，齐 琳，苏 晨，刘 洋，王兴国

(1.北京联合大学 生物化学工程学院， 北京 100023；2.河北省(邢台)核桃产业技术研究院， 河北 临城 054300)

核桃，为胡桃科植物果实，与扁桃仁、腰果及榛子并称“四大干果”[1]。核桃是我国重要的特色优势农产品，截至2018年底，我国核桃种植面积为816.57万ha，核桃年产量382万t，位居世界第一。核桃仁中脂肪、蛋白质、碳水化合物的含量分别约为65%、15%、14%，并含有多种维生素及矿物质，营养素全面且均衡。此外，核桃还富含多种功能成分，如胡桃醌、多酚、黄酮和多糖等，很早就被古人作为药材入药，可见，核桃是具有极高营养和保健作用的健康食材[2-5]。

近年来的研究发现许多植物多糖具有抗肿瘤、抗菌、增强免疫功能、降血糖、降血脂、抗氧化等多种保健作用[6-8]，多糖相关研究已成为近年来的研究热点，大豆多糖[9]、枸杞多糖[10]、香菇多糖等[11-12]已开发应用。核桃果实不同组织都含有多糖，如核桃青皮、核桃分心木(隔膜)、核桃壳、核桃楸仁多糖均有研究报道[13-27]。目前，研究内容主要集中在多糖的提取和生物活性方面，对多糖组成和结构研究还较少。核桃仁为核桃可食部分，其所含多糖不需提取即可被吸收利用，而当前对核桃仁多糖的研究极少。研究核桃仁多糖含量、结构组成及生物活性对深入了解核桃营养健康作用具有更深刻的现实意义。核桃仁中总糖质量分数约占14%，榨油之后的核桃粕，总糖可达40%，多糖浓度也随之增加，以核桃粕为原料研究核桃仁多糖对核桃粕高值化利用也具有重要的实践意义，因此核桃仁和核桃粕多糖的研究亟待开展。

本文对国内外核桃多糖的提取、分离纯化、含量测定、结构测定及生物活性的研究进展进行了全面的综述，以期为开展核桃多糖深入研究及开发利用提供参考和依据。

1 核桃多糖分离提取方法研究

目前，核桃多糖提取常用方法是热水浸提法，为提高多糖提取得率，前人利用酶解法、超声辅助法和微波法辅助法对多糖进行了提取，核桃不同组织以及不同提取方法与工艺对核桃多糖提取得率影响不同，核桃多糖提取工艺与结果分析比较见表1。

由表1可知，前人对核桃青皮多糖研究较多，热水浸提结合其他不同辅助方法多糖提取得率不同。超声辅助法提取多糖得率最高，平均为10.24%，其次是微波辅助提取得率为8.21%，单纯热水浸提提取得率为3.13%，酶法辅助提取得率为1.55%。可见超声辅助和微波辅助提取多糖是非常有效的提取方法，同时还能大大减少提取时间，降低提取温度，是一种高效的提取方法，其中超声辅助又好于微波辅助提取，具有很好的应用前景。

表1 不同工艺提取核桃多糖的研究结果Tab.1 Research results of extracting walnut polysaccharides by different processes

提取工艺条件中，纯热水浸提中提取温度和提取时间对多糖提取得率影响较大，提取温度在85 ℃以上，同时提取时间在150 min以上时，提取得率较高。料液比在1∶20 g·mL-1以上时提取效果较好。

由表1数据计算各组织部位多糖提取得率，青皮在3.13%～10.24%，核桃壳在2.2%～3.1%，核桃分心木多糖提取率最高，为17.42%。核桃楸仁是山核桃，核桃楸仁和青皮多糖提取得率分别在6%和12%以上，较普通核桃相应组织部位的多糖含量高。核桃青皮、核桃壳、核桃分心木含油脂、蛋白质极少，多糖提取影时响因素较少，但表1显示，核桃青皮多糖得率相差较大，核桃多糖提取工艺对多糖得率影响较大，多糖提取工艺需要进一步优化。

2 核桃多糖分离纯化方法研究

2.1 去除蛋白质

多糖提取液中常混有蛋白质，使用Sevag法、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、蛋白酶酶解法可以使蛋白质沉淀从而去除蛋白质，不同处理方法脱除核桃多糖中蛋白质的研究结果见表2。

从表2可知，体积分数为5%～10%的三氯乙酸脱蛋白的效率较Sevag法高，但多糖的损失率也较高，使用的强酸试剂可能会降解多糖，影响多糖结构以及活性。Sevag法需多次脱除操作，也能脱除80%以上的蛋白质，多糖损失率低，因使用有机溶剂进行实验，反应条件温和，不会对多糖结构造成影响，因此，采用Sevag法脱蛋白更好，脱除次数在5～7次较为适宜。酶法脱除蛋白质具有温和、无毒、蛋白质残留少等特点，但在核桃中的研究应用相对不多。

表2 Sevag法及TCA法去蛋白质纯化多糖Tab.2 Polysaccharide purification via removing protein by Sevag method and TCA method

2.2 透析法去除小分子物质

透析法是将多糖溶液放入透析袋中，在自来水、蒸馏水中透析，从而将小分子物质如小分子低聚糖、盐离子除去而使大分子物质截留在溶液中的分离方法。总结的核桃多糖在分离纯化时应用透析的研究数据见表3，透析袋分别选用了8 000、14 000 u和8 000～14 000 u的截留范围，去除小分子杂物，这种透析有可能导致分子质量小于8 000 u的多糖丢失。因此，透析袋型号的选用应考虑所提粗糖中多糖分子质量的分布，可分别选用不同截留分子质量透析袋透析，以减少型号选用不当造成多糖的损失[28]。

表3 透析法分离纯化核桃多糖Tab.3 Separation and purification of walnut polysaccharides by dialysis

2.3 沉淀法分离纯化

沉淀分离是根据多糖分子质量大小的不同及溶解能力的不同在有机溶剂中沉淀而得到多糖的分离方法，包括有机溶剂沉淀法如乙醇、丙酮，盐沉淀法如多糖与铜盐、季铵盐，形成不溶物而获得多糖，研究中常选择乙醇对核桃多糖进行沉淀。不同分子质量的多糖在不同浓度乙醇中的溶解能力存在差异，因此，可选用不同浓度乙醇分步沉淀分离不同性质的多糖，王文泽[18]利用体积分数为10%～100%(10%为梯度)的乙醇对核桃楸青衣多糖进行了分级沉淀和分步沉淀的研究，综合考虑最终确定沉淀方法为无水乙醇一次沉淀法。多糖醇沉所用乙醇浓度也不尽相同，一般选用70%～90%[14,20,28]。

2.4 柱层析法分离纯化

核桃多糖分离纯化时常使用的柱层析方法有纤维素柱层析法、离子交换柱层析法、凝胶柱层析法，进行不同分子质量多糖的分离和去杂，不同柱层析法对不同核桃组织多糖分离纯化的效果见表4。

表4 柱层析法分离纯化核桃多糖Tab.4 Separation and purification of walnut polysaccharides by column chromatography

前人采用了DEAE-纤维素25-52、SephadexG75-100以及大孔树脂柱层析法分离核桃分心木、核桃青皮和核桃楸青皮多糖，其中核桃分心木分离得到分子质量为0.701 5×104、1.305 7×104u的两种多糖，核桃楸青皮分离出4种分子质量分布在1.27×104～22.79×104u的多糖，核桃青皮仅做了Sephadex柱层析分离提高纯度达90%左右，未进行分子质量大小研究，而青皮中多糖含量相对较高，应对分子质量进行研究。由表4可知核桃楸青皮多糖组分多、分子质量较大。

经初步提取后的多糖中通常有脂肪、蛋白质、色素等杂质存在[33]，常采用Sevag法或TCA法去除蛋白质，透析或超滤去除小分子物质，用多种柱层析纯化方法对多糖进行进一步纯化。离子交换柱色谱法是纯化蛋白质、多糖等生物大分子的有效方法。核桃多糖有多种，分子质量大小不同，现有研究还不够深入，采用柱层析分离时，要认真分析、设计科学适宜的柱层析分离方法，才能减少分离纯化时多糖的损失。

3 核桃多糖含量及检测方法

植物多糖提取时常选用苯酚- 硫酸法和蒽酮- 硫酸法对多糖含量进行检测，苯酚硫酸法的稳定性和重复性要优于蒽酮硫酸法。表5为两种不同方法检测核桃不同组织多糖含量的结果对比。

由表5可知，核桃中多糖含量因品种、组织部位的不同具有一定的差异，核桃壳中含量最高，为22.22%，青皮7.48%以上，分心木约5.15%，核桃仁5.33%。两种测定方法中苯酚- 硫酸法测定值较蒽酮- 硫酸法所测值高出约5个数值，相差较大[36]，但也有文献报道蒽酮- 硫酸法测定值较苯酚- 硫酸法高[14]；核桃青皮干制法影响多糖含量，自然晒干的高于烘箱烘干的含量，高出6个数值，表明多糖对高温不稳定。表5中核桃不同组织材料多糖含量与表1中相应的组织材料多糖得率也不一致，分析原因，其一可能与多糖提取纯度有关，水溶醇沉方法提取可能使多种水溶的成分残留在粗多糖中，如蛋白质、多酚类成分，而这两种成分在核桃仁中含量都很丰富，导致提取多糖纯度不高；其二与粗多糖本身是一个多种糖分组成的混合物有关，不同提取方法、不同组织部位材料其成分组成会有差异，导致测定值不同；从前人研究结果中可知多糖提取包含多个处理，对多糖含量与稳定性的影响较大，是影响多糖纯度和含量准确的关键环节，因此，在多糖研究中一定要对提取环节进行精心设计和不同提取方法比较优化，以保证多糖研究数据的可靠性。

表5 苯酚- 硫酸法与蒽酮- 硫酸法测定核桃多糖含量Tab.5 Determination of walnut polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method

4 核桃多糖结构研究

目前，关于核桃多糖结构的研究多集中在一级结构的研究，常用红外光谱、核磁共振、质谱、气相色谱等方法进行分析研究，结构的分析有助于生物活性的研究。

4.1 多糖官能团特征的分析

核桃多糖红外光谱的扫描范围为400～4 000 cm-1，通过对多糖官能团的测定，可以分析不同组织部位的核桃多糖的基团和构型，有助于多糖结构分析，官能团特征信息见表6。

不同组织部位核桃多糖400～4 000 cm-1红外光谱扫描显示了多糖的基本官能团结构特征，都有糖醛酸官能团，表明核桃多糖为酸性多糖。核桃青皮和核桃内种皮多糖中有β构型，分心木多糖中有α-异头构型，其他团能团特征信息还需要进一步深入研究。

表6 红外光谱法分析多糖官能团特征Tab.6 Polysaccharide functional group characteristics analyzed by infrared spectroscopy

4.2 多糖分子质量的分析

前人通过凝胶渗透色谱分离山核桃、核桃青皮和分心木多糖分子质量信息见表7。多糖分子质量的大小影响着它的生物活性，如水溶性葡聚糖的分子质量需要大于9×104u才可能形成3股螺旋结构，从而可能具有一定的免疫活性，当分子质量为10×104～20×104u时其活性最强[14]。从表7数据可知，山核桃青衣多糖的分子质量为13.302 1×104u，可能存在一定的活性。

4.3 单糖组成的分析

核桃多糖的单糖组成见表8。

不同组织部位的核桃多糖的单糖组成差异较小，基本都含有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖，单糖组成在7个以上，各单糖组分占

表7 高效凝胶渗透色谱法及凝胶渗透色谱法分析多糖分子质量Tab.7 Analysis of polysaccharide molecular weight by high performance gel permeation chromatography and gel permeation chromatography

表8 不同组织部位核桃多糖的单糖组成及比例Tab.8 Monosaccharide composition and ratio of walnut polysaccharide in different tissue parts

比不同。核桃分心木中以鼠李糖、葡萄糖较多，核桃青皮多糖中以葡萄糖和半乳糖的比例较高，核桃壳多糖中以D-阿拉伯糖最多，其次是葡萄糖和半乳糖的比例较高。综合表6和表8可推测核桃多糖为酸性杂多糖，不同组织部位多糖单糖组成很接近。

由于多糖结构的复杂性，已有研究仅进行了核桃多糖结构单糖组成、糖苷键型、分子质量的初步研究，对多糖的高级结构还未涉及。

5 核桃多糖生物活性研究

众多学者对核桃不同组织部位的水提多糖进行了生物活性研究，核桃青皮、核桃壳、核桃分心木和核桃内种皮多糖均具有多种生物活性。

5.1 抗肿瘤

分离纯化的核桃分心木多糖具有抗肿瘤功效[45]。研究表明：核桃楸果水提物及分离出分子质量为2.279×105u的均一多糖对S180、H22、LWS造模小鼠肿瘤有抑制和抗癌活性[30，46]。

5.2 降血糖

核桃分心木水提液对糖尿病小鼠血糖和胰腺结构影响的研究表明核桃多糖可以降低患有糖尿病动物的血糖值[47]。核桃青皮多糖能够降低高果糖饮食小鼠的血糖浓度，对胰岛素抵抗具有调节作用[48]。分离纯化的核桃分心木多糖具有一定的降血糖作用[49]。

5.3 抗氧化

采用水杨酸法和邻苯三酚自氧化法测定核桃青皮多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，发现核桃青皮多糖的清除能力弱于维生素C[23]；核桃青皮多糖具有总抗氧化能力，其清除羟基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的能力弱于维生素C[26]。经过蒸汽热烫方法处理后的光核桃，其多糖含量及抗氧化活力得到了明显的提高[50]；核桃分心木多糖具有清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基和还原Fe3+的能力[51]；核桃青皮果胶具有清除DPPH自由基的能力[52]。

5.4 抑菌

分离纯化的核桃仁种皮多糖对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌有抑制效果[39]；分离纯化的核桃仁种皮多糖抑制酸奶霉菌的效果随其质量浓度的增加而增强，抑制霉菌的最佳质量浓度为500 mg/L[53]；分离纯化的核桃分心木多糖具有显著的抗菌活性[54]。

5.5 预防阿尔茨海默病

分别用水、乙醇和丙酮等3种溶剂对核桃仁进行提取，研究3种提取物对阿尔茨海默病模型大鼠 IL-1、IL-6 含量的影响，结果表明3种提取物均具有预防模型大鼠患阿尔茨海默病的作用[55]。

6 总结与展望

目前，对核桃青皮、核桃壳、核桃分心木、核桃内种皮及核桃楸多糖提取工艺已经进行了广泛的研究，对核桃多糖结构组成及生物活性方面进行了初步研究，为核桃多糖进一步深入研究及核桃仁多糖研究奠定了一定的基础，但研究中还存在一些问题需进一步改善提高。

6.1 核桃多糖研究的思考与建议

1)提取方法的改进与优化。核桃青皮、壳、分心木及核桃内种皮和核桃仁中都含有丰富的多酚和黄酮类成分，提取过程中极易氧化褐变，影响多糖提取物色泽和含量准确性的测定，可考虑先进行乙醇脱酚处理，再提取多糖，降低提取中的杂物，提高多糖纯度。

2)多糖的分离纯化。核桃多糖种类较多，分子质量主要集中在7 015～13 057 u，可据此选择或设计适宜的分离纯化工艺，尽可能多的保留提取的多糖。

3)多糖含量的测定方法。目前，提取多糖的测定均是采用苯酚- 硫酸法或蒽酮- 硫酸法，但两种方法所测多糖值相差较大，这种差异是两种方法的系统误差所致，因此，需对两种方法进行评价，并进行相关性分析。

4)多糖结构与生物活性研究。鉴于多糖结构研究的复杂性和烦琐性，及前人用多糖提取物研究其生物活性也获得相应的结果，建议采用较高纯度的多糖先进行多糖活性研究，在活性研究的基础上开展结构特性研究。

6.2 核桃仁多糖研究展望

核桃多糖研究中的研究材料多是不可食用的副产物，而对可食用的桃核桃仁多糖研究极少。核桃仁中的多糖不需要提取，直接食入体内而发挥作用，因此，开展核桃仁多糖研究对提升核桃营养健康价值具有很重要的现实意义。核桃油是核桃仁之精华，其加工副产物核桃粕目前尚未得到很好的利用，核桃粕因核桃油的分出，其所含其他成分得到浓缩，碳水化合物含量约占40%，多糖浓度也相应提高，这有利于开展多糖研究。因此开展核桃粕多糖提取、结构组成和生物活性研究对充分利用核桃资源和更好的发挥核桃的营养保健作用有着重要的理论和实践意义。核桃粕主要成分是蛋白质，其次是碳水化合物和残留少量的核桃油，再其次是核桃酚类化合物，极富营养价值，目前利用核桃粕提取蛋白制备核桃多肽研究较多，如能在提取蛋白的基础上，在前人核桃多糖研究基础上高效开展核桃多糖研究，不仅阐明核桃仁多糖含量、组成结构、生物活性，而且能够充分实现核桃粕高值化利用，促进核桃精深加工，延长核桃深加工产业链，提高产业链效益，对实现核桃产业链的提质增效具有重要的实践意义。