肾癌环状RNA表达谱和调控通路分析△

纪梓良，路瑞静，陈忠，温志强，郑清友#

1南方医科大学深圳医院泌尿外科，广东深圳518101

2深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳518133

肾癌是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，是第二常见的泌尿系统恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的3%。2018年全球新诊断的肾癌患者约403 262例，约占2018年所有新诊断恶性肿瘤患者的2.2%；因肾癌死亡患者约175 098例，约占2018年因恶性肿瘤死亡患者的1.8%。尽管临床上已经使用了许多分子靶向药物，但晚期肾癌患者的预后仍然很差。因此，迫切需要进一步阐明肾癌的发病机制，并寻找更有效的肿瘤标志物和治疗靶标。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是继微小 RNA（microRNA，miRNA）及长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）后，RNA家族又一逐渐被人们认识的新的内源性非编码RNA。由于circRNA的3'和5'端相连形成共价闭环结构，因此，没有传统的线性RNA 5'帽结构或3'聚腺苷酸尾巴，这使它们比线性RNA更稳定。circRNA富含miRNA反应元件，可以充当miRNA的海绵，从而减少miRNA对靶mRNA的抑制作用。近年来，研究表明，circRNA参与了多种肿瘤的发生、发展，如乳腺癌和前列腺癌，但circRNA在肾癌中的作用和功能仍未完全阐明。本研究对3例肾癌患者的肾癌组织及癌旁正常肾组织进行高通量测序，检测肾癌环状RNA表达谱，结合生物信息学的方法预测差异表达的circRNA在肾癌中的调控通路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月南方医科大学深圳医院行手术切除的肾癌患者3例，分别为44岁男性（肿瘤分期为TNM期）、48岁女性（肿瘤分期为TNM期）、55岁男性（肿瘤分期为TNM期）患者，收集其肾癌组织标本及癌旁（距肿瘤边缘＞5 cm）正常肾组织标本。纳入标准：术后病理检查均证实为肾透明细胞癌。排除标准：有化疗、放疗或其他肿瘤史。

1.2 RNA提取和高通量测序

使用TRIzol试剂（Life Technologies，美国）从组织中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计（Isogen Life Science，荷兰）测量RNA样品的浓度和纯度。若OD值/OD值为1.8～2.1，则RNA样品的纯度合格。由上海天昊生物科技公司（中国）进行高通量测序。通过EpicentreRibo-ZerorRNA去除试剂盒（Epicentre Technologies，美国）消除了核糖体RNA之后，使用Illumina平台的NEBNextUltra定向RNA库制备试剂盒（NEB，美国）构建RNA库。使用Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent Technologies，美国）对RNA库进行质量控制和定量评估。

1.3 circRNA鉴定及分析

使用生物信息学程序识别circRNA，包括CIRI2（v2.0.6 版）、CIRCexplorer2（v2.3.3 版）、Mapsplic（ev2.2.1版）、circRNA_finde（rv1.1版）和find_circ（v1.2版）。从GENCODE数据库下载基因注释文件（gencode.v19版）和参考基因组（GRCh37.p13版）。通过FastQC评估RNA-seq数据的质量并去除低质量读数后，获得纯净的读数，并使用指定读数比对仪将其定位至参考基因组。将获得的circRNA与circBase（140 790个circRNA）数据库进行比较，确定是否为新发现的circRNA。提取每个circRNA的反向剪接连接点读数确定circRNA的表达量，用R软件包对数据进行归一及后续的差异表达的circRNA分析，倍数变化大于2且

P

＜0.05的circRNA被认为是显著差异表达的circRNA。

1.4 circRNA/miRNA/靶基因调控通路预测

使用regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）、circRNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）和starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测circRNA/miRNA/mRNA的调控通路。使 用 miRNAda（http://www.microrna.org/）和Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）预 测 相关miRNA的潜在靶基因。使用Cytoscape软件构建circRNA/miRNA/mRNA网络。

2 结果

2.1 circRNA在肾癌组织中的表达谱特征

通过高通量测序鉴定circRNA在肾癌组织及癌旁正常肾组织中的表达谱，共鉴定出4661个circRNA，其中有1963个为新发现的circRNA，89.89%（4190/4661）circRNA是外显子circRNA，其余的circRNA包括4.66%（217/4661）内含子circRNA和5.45%（254/4661）基因间circRNA。这些circRNA广泛分布在整个人类染色体中，其中，2号染色体包含463个circRNA，而Y染色体仅包含10个circRNA（表1）。circRNA的长度为78～181 652 nt，其中位长度为652 nt，43.77%的circRNA长度为200～600 n（t表2）。

表1 circRNA在肾癌组织中的染色体分布情况

表2 circRNA在肾癌组织中的长度分布情况

2.2 肾癌和癌旁正常组织中circRNA的表达情况

在4661个被发现的circRNA中，1504个cir-cRNA仅于肾癌组织中被检测到，1840个circRNA仅于癌旁组织中被检测到，而1317个circRNA在肾癌及癌旁组织中均有表达。与癌旁组织相比，肾癌组织中共发现53个显著差异表达的circRNA，包括21个表达上调和32个表达下调的circRNA（倍数≥2.0，P＜0.05）。表达上调和下调倍数最高的各4个circRNA（表3）。

表3 肾癌组织中表达上调或下调倍数最高的circRNA

2.3 circRNA/miRNA/mRNA调控网络的构建

为了进一步研究肾癌中circRNA的潜在生物学功能及调控通路，选取表达差异倍数最高的4个下调和上调的circRNA（表3），利用生物信息学程序构建一个预测的circRNA/miRNA/mRNA相互作用网络（图1）。该网络结合了测序结果中circRNA、mRNA的表达趋势，以及miRNA与circRNA、miRNA与mRNA预测的调控关系，其中每个circRNA均能与多个miRNA相结合。如表达上调的hsa_circ_0001947能调控miRNA-203b-3p、miRNA-7152-3p、miRNA-26b-3p、miRNA-12114，进而影响下游钙黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）、卵泡抑素（follistatin，FST）、脑啡肽受体 B1（Ephrin receptor B1，EPHB1）、OCA2等基因的表达。

图1 circRNA/miRNA/mRNA调控网络图

3 讨论

随着高通量测序技术的出现，人们发现仅有2%的人类基因组可以翻译成蛋白质，而98%的人类基因组仅能转录成非编码RNA。非编码RNA分为 miRNA、小核RNA、lncRNA和circRNA。circRNA是RNA领域的研究重点。随着高通量测序技术和生物信息学方法的发展，circRNA在人类肿瘤中的表达情况及作用正逐渐被认识。作为一种基因调控RNA，circRNA已牵涉到多层次的基因调控中，包括替代剪接、miRNA成熟抑制、基因转录、RNA-蛋白质相互作用和蛋白质编码能力。miRNA“海绵”功能是circRNA的重要功能。circRNA能够吸附并调控靶miRNA，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表达水平。

越来越多的证据表明circRNA在肾癌的发生发展中起着重要的作用，例如circRNA_001569能够作为miRNA-192的分子海绵，促进结肠癌的增殖、侵袭。Liang等通过高通量测序发现circRNA_ABCB10在乳腺癌中呈高表达，且能够通过作为miRNA-1271的分子海绵下调miRNA-1271的表达，从而发挥致癌基因的作用。Zhang等发现，circ-UBAP2能够通过调控miRNA-143在骨肉瘤中的表达从而发挥促癌作用。而在肾癌中，Xue等发现circ-AKT3通过改变miRNA-296-3p/E-钙黏蛋白信号抑制肾癌细胞的转移。Xiong等发现，circRNA-ZNF609通过竞争miRNA-138-5p，进而调节FOXP4的表达，从而促进肾癌细胞的增殖和侵袭。Li等发现circTLK1通过调控miRNA-136-5p的表达从而促进肾癌细胞的增殖和转移。

为阐明肾癌中环状RNA的表达谱特征，本研究对3例肾癌患者的肾癌组织及癌旁正常组织进行高通量测序，共鉴定出4661个circRNA，其中有1963个为新发现的circRNA。大多数circRNA是外显子circRNA，其余的为内含子circRNA和基因间circRNA。这些circRNA广泛分布在整个人类染色体中，其中，2号染色体包含最多的circRNA（463个），而Y染色体仅包含10个circRNA。circRNA的 长 度 为 78～181 652 nt，中 位 长 度 为 652 nt，43.77%的circRNA长度为200～600 nt。通过比较肾癌及癌旁组织中circRNA的表达情况，本研究共鉴定出53个在肾癌组织中显著异常表达的circRNA，包括21例表达上调和32例表达下调的circRNA（倍数≥2.0，

P

＜0.05）。此外，为了进一步研究肾癌中circRNA的潜在生物学功能及调控通路，本研究选取表达差异倍数最高的4个下调和上调的circRNA，构建了circRNA/miRNA/mRNA调控网络图，该网络图将为后续肾癌中circRNA-miRNA相互作用通路的研究提供理论基础，进一步了解circRNA在肾癌发生、发展中的作用，并预测其可能的调控通路。例如，在预测图中，高表达的hsa_circ_0001947能通过调控miRNA-203b-3p的表达，从而影响碱性双螺旋转录调控因子e41（basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41）基因的表达。Dasgupta等发现，miRNA-203b-3p在肾癌中呈明显低表达，且能抑制肾癌细胞的增殖和侵袭。Shen等却发现，

BHLHE41

在肾癌组织中呈高表达，且能促进肾癌细胞的增殖。因此可以推测，在肾癌中高表达的hsa_circ_0001947能够海绵状吸附miRNA-203b-3p，降低其表达后，解除了miRNA-203b-3p对

BHLHE41

的抑制作用，最终引起

BHLHE41

基因的高表达，从而促进肾癌的发生发展。该网络图能为肾癌circRNA的研究提供方向，并筛选可能有意义的circRNA调控通路。当然，仅预测是不够的，后期仍需进一步的体内试验、体外实验加以验证。

综上所述，本研究阐明了肾癌中circRNA的表达特征，在肾癌组织中鉴定到了1963个新发现的circRNA，并发现了53个在肾癌组织中显著异常表达的RNA。通过生物信息学方法在肾癌中预测并构建了circRNA/miRNA/mRNA调控网络图，为后续肾癌circRNA相关研究奠定了理论基础。后期除了扩大样本量验证circRNA的表达外，仍需进一步阐明差异表达的circRNA在肾癌中的生物学功能和确切的分子机制。