转录因子E2F1 及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立

安娇，朱长军，王雅洁*

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

转录因子E2F1 最早是在研究腺病毒E2 启动子的过程中发现的[1]，是E2F家族中被研究最多的成员。研究表明，E2F1 通过转录调控各种下游关键靶基因的表达参与各种基本细胞生命活动过程，是细胞增殖和细胞凋亡的关键调控因子。一方面，E2F1 参与了细胞周期从G1 期到S 期的转换[2]；另一方面，E2F1还通过p53 依赖型以及p53 非依赖型两种细胞信号通路发挥促凋亡功能[3]。E2F1 在乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中高表达，并通过影响细胞凋亡、血管生成、肿瘤转移侵袭和细胞耐药等进程来促进肿瘤的发生发展[4-5]。但是E2F1 在肿瘤细胞中的作用机制仍不完全清楚。

在人体内，转录因子E2F1 位于染色体20q11，片段长度约11 kb，编码437 个氨基酸组成的蛋白质。E2F1 主要功能域包含cyclin A 结合功能域、DNA 结合功能域、DP 结合功能域、Marked box 功能域、转录激活功能域和Rb 结合功能域。

本研究构建了真核细胞表达质粒pFlag-E2F1 及其DNA 结合功能域突变体质粒pFlag-E2F1E132，并进一步获得了与之对应的稳筛细胞株。这些细胞株对E2F1 的关键下游靶基因的筛选具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

HeLa 细胞和pFlag 真核细胞表达载体由天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室提供；pCMV-E2F1 表达质粒由中国科学院水生生物研究所生物多样性与水生生物保护重点实验室馈赠。

1.2 试剂与仪器

胎牛血清、DMEM细胞培养基，Biological Industries公司；Lipofectamine 3000 转染试剂，Thermo Fisher Scientific 公司；高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪公司；……