高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾渗透调节的影响

熊大林，段亚飞，陈成勋，孙永旭，董宏标，詹爱军，张家松

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300; 2.天津农学院 水产学院，天津 300384; 3.深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳 518010 )

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是我国重要的水产养殖经济虾类。随着对虾集约化养殖程度的提高、环境胁迫频发，导致对虾死亡率居高不下，造成养殖业严重的经济损失。氨氮是对虾养殖中重要的环境胁迫因子[1-3]。尤其在广东高温季节，水环境中氨氮含量骤升现象经常发生，高含量的氨氮胁迫造成对虾抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等，危害对虾的存活和生长[4-7]。凡纳滨对虾生长适宜温度为25～32 ℃[8]，当温度超过33 ℃，生长速率和存活率降低[9]。水温27 ℃、pH 8.15、盐度20条件下，氨氮对体长5 cm的凡纳滨对虾的72 h半致死质量浓度为31.44 mg/L[10]，随着凡纳滨对虾的生长，其对氨氮的敏感度会有所降低。氨氮质量浓度受温度的影响，非离子氨含量与温度呈正相关[11-12]。随着温度的升高，氨氮对短沟对虾(Penaeussemisulcatus)[13]、河蚬(Corbiculafluminea)[14]的半致死质量浓度不断降低，毒性不断增强。

甲壳动物对环境胁迫的生理适应性与其渗透压调节活动密切相关。Lignot等[15]认为，机体渗透压变化可作为监测甲壳动物生理状况和受环境胁迫影响的指标之一。甲壳动物的渗透压调节方式分为非等渗细胞外调节和等渗细胞内调节两类，前者主要依靠Na+/K+-ATP酶等离子转运酶调节机体无机离子的含量，而后者则是弥补非等渗细胞外调节的缺陷，利用游离氨基酸平衡组织和血淋巴之间的渗透压[16-17]。此外，Na+/K+-ATP酶及游离氨基酸还具有调节能量输出及氨解毒作用[18-19]。研究发现，在环境胁迫下，Na+/K+-ATP酶α、Na+/K+-ATP酶β等离子通道相关基因、水通道蛋白基因表达量和酶活性增加[20-22]；酶在细胞膜上的定位显示，部分酶作用于细胞质上，促进渗透压的调节[23]。甲壳动物在受到盐度、氨氮、多氯联苯等胁迫时，其游离氨基酸含量均发生显著变化[24-26]。由此可知，游离氨基酸和ATP酶在甲壳动物逆境的渗透压调节过程中发挥重要作用。

然而，目前关于高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾游离氨基酸含量以及Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的影响研究尚未见报道，其对解析环境胁迫对凡纳滨对虾渗透压调节的影响机理具有重要意义。因此，笔者测定由正常水温30 ℃急升至33 ℃，不同氨氮质量浓度胁迫对凡纳滨对虾鳃中Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性以及肌肉和鳃中游离氨基酸含量的影响，旨在探讨高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾渗透调节的影响作用，以期为凡纳滨对虾的健康养殖提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年7月在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行。健康凡纳滨对虾平均体质量(6.77±0.51) g，于200 L玻璃纤维桶中，每桶50尾，暂养7 d。暂养期间水温30 ℃、盐度30、pH 8.4，持续充氧，每日更换2/3体积海水，按其体质量5%定时投喂对虾配合饲料。

1.2 急性升温下氨氮胁迫试验

将暂养7 d的健康凡纳滨对虾随机分为24组，每组50尾。试验设置2个温度梯度，每温度下设置4个氨氮质量浓度组，共8个试验组，每组3个平行。温度设常温对照(30 ℃)、高温胁迫(33 ℃)；氨氮胁迫设对照(0 mg/L)、低质量浓度(5 mg/L)、中质量浓度(15 mg/L)和高质量浓度(25 mg/L)。33 ℃组水温用加热棒在1 h内由30 ℃急升至33 ℃，并进行恒温控制。各组水体氨氮质量浓度分别以氯化铵溶液进行调节，每4 h使用靛酚蓝分光光度法(GB 17378.4—2007)检测水中氨氮质量浓度，维持质量浓度稳定。试验期间，每日换水1/3，日常管理与暂养期间相同。于胁迫72 h后，每组分别取10尾凡纳滨对虾的鳃组织和40 g肌肉组织，冷冻保存在液氮中，用于测定酶活性和游离氨基酸含量。

1.3 ATP酶活性测定

鳃组织样品冰上解冻后，于预冷的0.9%生理盐水中漂洗去除组织液，滤纸拭干；称量质量后置于离心管中，按照m(组织)∶V(生理盐水)=1∶9的比例混合，低温研磨制成组织匀浆后，4 ℃、1000 r/min离心5 min，取上清液用于测定酶活性。

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性以及总蛋白含量。总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。

1.4 游离氨基酸含量测定

参考《实用食物营养成分分析手册》[27]中游离氨基酸的提取方法，将各组鳃和肌肉样品分别制成匀浆，称取15 mg置于水解管中，加入6 mol/L盐酸10 mL以及新蒸馏的苯酚3滴，再将水解管冷冻3 min后抽真空，充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复3次后，将充足氮气的水解管密封后于110 ℃干燥水解22 h。水解完成后取出冷却，将水解液过滤，用去离子水反复冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内，用真空干燥器在40 ℃干燥，残留物用1 mL水溶解，再干燥，反复进行2次，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解。

准确吸取0.20 mL混合氨基酸标准液，用pH 2.2的缓冲液稀释至5 mL，此标准稀释液浓度为 0.5 nmol/μL，作为上机测定用的氨基酸标准，以外标法用氨基酸自动分析仪测定样品测定液的氨基酸含量(w)。

式中，n为上机样品液中氨基酸量，f为样品的稀释倍数，Mr为氨基酸的相对分子质量，m为样品质量(g)，V为上机时的进样量。

1.5 数据分析

所得数据以平均值±标准误表示，采用SPSS 19.0软件进行方差分析和多重比较(LSD法和Duncan法)，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中ATP酶活性的影响

高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中Na+/K+-ATP酶活性的影响见图1。同一温度下，30 ℃时仅25 mg/L氨氮组Na+/K+-ATP酶活性显著升高(P<0.05)；33 ℃时Na+/K+-ATP酶活性随氨氮质量浓度的升高呈现显著先升后降又升的趋势(P<0.05)。同一氨氮质量浓度下，氨氮质量浓度为5 mg/L时，33 ℃组Na+/K+-ATP酶活性显著高于30 ℃组(P<0.05)；而氨氮质量浓度为0、15、25 mg/L时，33 ℃组Na+/K+-ATP酶活性显高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中Ca2+-ATP酶活性的影响见图2。同一温度下，30 ℃时仅5 mg/L氨氮组Ca2+-ATP酶活性显著升高(P<0.05)，而33 ℃组Ca2+-ATP酶活性随氨氮质量浓度的升高呈现先升后降的趋势(P<0.05)，氨氮质量浓度为15 mg/L时酶活性最高。同一氨氮质量浓度下，氨氮质量浓度为15 mg/L时，33 ℃组Ca2+-ATP酶活性显著高于30 ℃组(P<0.05)；而氨氮质量浓度为0、5、25 mg/L时，33 ℃组Ca2+-ATP酶活性显著低于30 ℃组(P<0.05)。

著低于30 ℃组(P<0.05)。

图1 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中Na+/K+-ATP酶活性的影响Fig.1 Combined effects of high temperature and ammonia stress on Na+/K+-ATPase activity in the gills of Pacific white shrimp L. vannamei不同字母表示同一温度下不同氨氮质量浓度组间差异显著(P<0.05)； *表示同一氨氮质量浓度下不同温度组间差异显著(P<0.05)；下同.Means with different letters are significant diferences between different ammonia concentrations in each temperature treatment (P<0.05)； * indicates significant differences between two temperatures within the same ammonia treatment (P<0.05); et sequentia.

图2 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中Ca2+-ATP酶活性的影响Fig.2 Combined effects of high temperature and ammonia stress on Ca2+-ATPase activity in the gills of Pacific white shrimp L. vannamei

2.2 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中游离氨基酸含量的影响

高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中游离氨基酸含量的影响见表1。同一温度下，30 ℃时仅5 mg/L氨氮组游离氨基酸总含量显著降低(P<0.05)，其他氨氮组间差异不显著。而33 ℃时游离氨基酸总含量随氨氮质量浓度的升高呈先升后降的趋势(P<0.05)，氨氮质量浓度为5 mg/L时游离氨基酸总含量最高。同一氨氮质量浓度下，氨氮质量浓度为5 mg/L时，33 ℃组游离氨基酸总含量显著高于30 ℃组(P<0.05)，而在氨氮质量浓度为15 mg/L和25 mg/L时均显著低于30 ℃组(P<0.05)。脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸是鳃中游离氨基酸的主要成分，其中脯氨酸和甘氨酸含量在30 ℃和33 ℃氨氮胁迫下的变化趋势与游离氨基酸总含量一致。

表1 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中游离氨基酸含量的影响 mg/g

2.3 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾肌肉中游离氨基酸含量的影响

高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾肌肉中游离氨基酸含量的影响见表2。同一温度下，30 ℃时游离氨基酸总含量随氨氮质量浓度的升高而显著升高(P<0.05)，而33 ℃时游离氨基酸总含量随氨氮质量浓度的升高呈先降后升的趋势(P<0.05)。同一氨氮质量浓度下，33 ℃组游离氨基酸总含量在氨氮质量浓度15 mg/L和25 mg/L时均显著低于30 ℃组(P<0.05)。甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸是肌肉中游离氨基酸的主要成分，其中30 ℃和33 ℃氨氮胁迫下，丙氨酸均随氨氮质量浓度的升高显著升高，且同一氨氮质量浓度下33 ℃组均显著高于30 ℃组(P<0.05)；精氨酸和脯氨酸含量的变化与游离氨基酸总含量的变化趋势一致。

表2 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾肌肉中游离氨基酸含量的影响 mg/g

3 讨 论

3.1 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中ATP酶活性的影响

离子转运酶在甲壳动物渗透压调节中发挥重要作用。机体依靠离子转运酶将离子跨膜运输，抑制环境变化造成的离子被动扩散，维持血淋巴渗透压和离子平衡[28]。当环境因子的改变使甲壳动物排氨受阻时，几种膜转运蛋白(H+-ATP酶、Na+/H+交换剂、Na+通道)会与Rhesus(Rh)糖蛋白共同实现Na+/NH4+交换，促进氨排泄和Na+吸收[29]。Pinto等[23]的研究表明，氨氮胁迫72 h，亚马逊沼虾(Macrobrachiumamazonicum)Na+/K+-ATP酶和V型H+-ATP酶活性比对照组升高了1.5～2.0倍；氨氮质量浓度变化导致V型H+-ATP酶在鳃支柱细胞的顶端凸缘和支柱细胞内均存在，由此推断虾通过提高离子转运途径调节渗透压平衡，促使部分新合成的酶定位到细胞质内，提高NH3向NH4+的囊泡转化。离子转运酶的调节能力也会受到氨氮胁迫量的影响。Lee等[30]研究表明，氨氮胁迫8 h后，高氨氮胁迫组(10.106 mg/L和20.093 mg/L)中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)的Na+/K+-ATP酶活性显著低于低氨氮胁迫组(5.043 mg/L和0.037 mg/L)。Shrivastava等[20]将鲤鱼(Cyprinuscarpio)在氨氮浓度为0.27 mmol/L(10% 96 h半致死浓度)的环境下预适应3～7 d后，再转至1.35 mmol/L氨氮浓度(50% 96 h半致死浓度)下胁迫12 h和48 h，鲤鱼存活时间更长，与Na+/NH4+交换有关的Rhesus (Rh)糖蛋白、Rhcg-α和Rhcg-β mRNA和蛋白表达水平均显著上调，且Na+/H+交换剂(NHE-3)、Na+/K+-ATP酶活性和mRNA表达同样显著升高。在致死和亚致死氨氮胁迫下机体的渗透压调节效果明显，但氨氮胁迫时间过长或含量较高时，调节效应会减弱。

本试验中，无氨氮胁迫时，33 ℃组凡纳滨对虾Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比30 ℃组显著降低，表明急性升温会抑制凡纳滨对虾渗透压调节相关酶活性。在33 ℃时氨氮胁迫下，Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性在低、中质量浓度组呈现出不同的变化。低氨氮质量浓度时Na+/K+-ATP酶活性升高，中氨氮质量浓度时活性最低，与Na+/K+-ATP酶不同，Ca2+-ATP酶活性在低氨氮质量浓度时增加不显著，而在中氨氮质量浓度时达到最高。这表明高温与氨氮复合胁迫下低浓度氨氮对凡纳滨对虾渗透压调节能力有一定的诱导作用，凡纳滨对虾通过Na+/K+-ATP酶调节渗透压以及排氨的能力最强。已有研究表明，水中盐度、K+、Mg2+和Ca2+之间具有交互作用，对凡纳滨对虾的生长存活和Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均有显著影响[31]。因此，推测在低、中质量浓度氨氮胁迫下，Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶协同发挥渗透压调节作用，但氨氮影响了水体中的离子变化，引起机体对离子的吸收存在差异，造成两种酶之间出现相反情况，并且在此影响下中质量浓度组Na+/K+-ATP酶活性比高质量浓度组还要低。在高氨氮质量浓度时，33 ℃下Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均显著低于30 ℃时的酶活性，可能是胁迫造成鳃组织损伤，导致机体细胞膜通透性增加，离子转运能力降低，影响了机体的渗透压调节功能。

3.2 高温与氨氮复合胁迫对凡纳滨对虾组织中游离氨基酸含量的影响

游离氨基酸为重要平衡组织和血淋巴间渗透压的细胞渗透调节物[32]。张丹等[24]研究表明，凡纳滨对虾在周期性盐度波动下，随着盐度的升高，肌肉和鳃游离氨基酸总量均有增加趋势；其中甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸是肌肉游离氨基酸的主要成分，而鳃中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸比例较高。当机体遭遇环境胁迫时，游离氨基酸还具有排氨和能量输出的功能。甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸是对虾渗透压主要效应物[33]，其中丙氨酸还是氨解毒途径中的重要效应物[25]。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)受盐度胁迫时，随盐度的升高，甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量显著增加，盐度50时氨基酸上升幅度分别为盐度10时的1.84倍、1.59倍和5.60倍[34]。精氨酸是一氧化氮合成的前体，一氧化氮能够刺激哺乳动物的肝脏和肌肉中的葡萄糖摄取和氧化以及脂肪酸氧化[35]，在机体抵御病原感染中发挥重要作用[36-38]。Costas等[39]研究发现，塞内加尔舌鳎(Cynoglossussenegalensis)离水在空气中暴露3 min，血清中精氨酸含量降低。凡纳滨对虾受急性低温胁迫时，血清中精氨酸含量随温度降低而显著升高[40]。

本试验中，凡纳滨对虾肌肉中甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和丝氨酸为游离氨基酸的主要成分，而鳃中游离氨基酸主要为脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸，这与张丹等[24]的研究结果相似。33 ℃时氨氮胁迫下，鳃组织中游离氨基酸含量在低氨氮质量浓度5 mg/L时显著升高，而在高氨氮质量浓度15 mg/L和25 mg/L时均显著降低；肌肉中游离氨基酸含量在氨氮质量浓度5、15 mg/L和25 mg/L时均显著降低。在30 ℃氨氮胁迫下，凡纳滨对虾鳃中甘氨酸与脯氨酸含量显著升高，而在33 ℃和氨氮复合胁迫下，凡纳滨对虾鳃中甘氨酸与脯氨酸含量以及肌肉中精氨酸和脯氨酸显著降低。与游离氨基酸含量变化趋势一致；无论是30 ℃氨氮胁迫还是33 ℃氨氮胁迫下，凡纳滨对虾肌肉中丙氨酸均随氨氮质量浓度的升高显著增加，且33 ℃组显著高于30 ℃组。由此推测，单一因素的氨氮胁迫对对虾渗透压调节有诱导作用，机体为实现氨解毒代谢，不断以氨基酸的形式将氨代谢；而高温与氨氮复合胁迫下，机体的解毒代谢达到负荷，排氨能力受到影响，不利于对虾渗透压的调节。

4 结 论

高温与氨氮复合胁迫72 h，凡纳滨对虾鳃中Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性以及肌肉和鳃中游离氨基酸含量均发生显著变化，表明高温与氨氮复合胁迫造成对虾渗透压生理调节功能紊乱。本试验中的几种生理指标对高温和氨氮复合胁迫的反应均较为敏感，可以作为对虾渗透压生理调节研究的评价指标。