化瘀通阳方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-1β、IFN-γ表达的影响

刘 雨，施丽婕，杨 洁，耿 洁，柴士伟

(1. 天津中医药大学研究生院，天津 300193；2. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300000)

溃疡性结肠炎是一种侵及结肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、体重减轻等，部分患者会出现肠病性关节炎、肝胆管疾病等肠外表现[1]。溃疡性结肠炎的发病机制尚未明确,多认为其发生发展与遗传、免疫、环境、饮食等多种危险因素相关。多因素共同作用易触发上皮屏障功能的改变，导致免疫细胞的激活和细胞因子的产生，细胞因子作为信号分子可通过产生炎症介质和激活炎症途径参与溃疡性结肠炎的病理性进展[2-3]。目前西医常用糖皮质激素、免疫抑制剂、氨基水杨酸等药物治疗溃疡性结肠炎，但对于少数严重的复发性或慢性无缓解的患者缺乏有效治疗方式，糖皮质激素可能存在依赖和抵抗，采用单纯的西药治疗效果并不理想，越来越多的临床工作者转向研究中医中药治疗。本课题组前期研究表明溃疡性结肠炎的主要病机为卫阳郁滞，瘀阻肠络，以此立论的化瘀通阳方组方精简，治疗溃疡性结肠炎疗效显著[4]。本研究通过建立溃疡性结肠炎大鼠模型，观察化瘀通阳方对溃疡性结肠炎模型大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响，以探讨其治疗的免疫机制，为临床应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SPF级Wistar大鼠32只，8周龄，体重(190±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2016-0006，常规饲养于屏障隔离环境中，12 h光照/黑夜循环，温度20～24 ℃，湿度40%～60%；自由饮食饮水，适应性饲养1周后开始实验。

1.2实验药物 化瘀通阳方药物组成：蒲黄10 g、五灵脂10 g、薤白10 g，由天津中医药大学第一附属医院药剂科提供。参照徐叔云教授主编的《药理实验方法学》剂量换算方法计算，成人体重按70 kg估算，大鼠体重按200 g估算，得出大鼠用药的等效剂量相当于成人的6.3倍。前期实验证实以5.4 g/kg的化瘀通阳方给药改善肠黏膜炎症效果显著，大鼠灌胃容积为10 mL/kg，相应药物浓度为0.54 g/mL，故按照中药常规煎法制成该浓度的药液，放入4 ℃冰箱保存备用。美沙拉嗪灌肠液(德国莎尔福Falk药厂，批号：17B16)，同样按人与动物等剂药物量换算方法，得出大鼠的适宜用药剂量为0.36 g/kg，相应药物浓度为 0.036 g/mL，用无菌饮用水稀释原药液至此浓度，现配现用。

1.3实验试剂 葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS，美国MP公司，批号：18008540530)，生理盐水(天津博泰亿达生物科技有限公司)，无水乙醇、冰醋酸、邻联甲苯胺、30%过氧化氢溶液(天津博泰亿达生物科技有限公司)，PBS缓冲液，大鼠IL-1β、IFN-γ酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，EK0393)，4%多聚甲醛(天津博泰忆达生物科技有限公司)，苏木素-伊红染色液、二甲苯溶液(北京百浩生物有限公司)。

1.4主要仪器 移液枪(Dragon Medical Company Limitied)，显微镜(日本欧林巴斯公司)，切片机(德国莱卡公司)，脱水机(美国赛默飞公司)，包埋机(美国赛默飞公司)，低温离心机，多功能酶标仪，恒温箱。

1.5造模、分组及干预 随机选取8只大鼠作为空白组，自由饮用蒸馏水；余24只大鼠采用 DSS 自由饮用结合灌胃方法[5-6]建立溃疡性结肠炎模型，具体操作：配制5%的DSS溶液，大鼠自由饮用及每只每日4 mL灌胃1次，连续7 d。所有大鼠均正常饮食,造模大鼠中死亡3只，空白组大鼠无死亡。造模第7天结束后，随机抽取4只造模大鼠和空白组2只大鼠处死，取结肠组织制作病理切片，镜下对照观察，用以判断大鼠模型是否建立成功。将造模成功的17只大鼠按随机数字表法随机分为模型组5只、美沙拉嗪组6只、化瘀通阳方组6只。化瘀通阳方组予0.54 g/mL化瘀通阳方药液灌肠，美沙拉嗪组予0.036 g/mL美沙拉嗪灌肠液灌肠，模型组和空白组予生理盐水灌肠，均每日1次，每次2 mL，连续灌肠10 d。

1.6观察指标及方法

1.6.1一般状况及疾病活动指数(DAI) 观察造模及灌肠期间大鼠的精神状态、进食量、活动情况、皮毛情况(密度、光泽等)，并记录每日每只大鼠的体重，每日通过腹部按摩法促使大鼠排便，于肛周消毒后自大鼠肛门处无菌采集粪便，观察大便性状，并采用邻联甲苯胺法[7]进行便隐血检测。参照Cooper等[8]的评分标准进行DAI评分：体重、大便性状正常，便隐血阴性记0分；体重下降1%～5%，松散便，隐血(+)记1分；体重下降6%～10%，松散便，隐血()记2分；体重下降11%～15%，稀便，隐血()记3分；体重下降> 15%，稀便，肉眼血便记4分。DAI =(体重下降率分数+大便性状分数+便血分数)/3。

1.6.2血清中IL-1-β、IFN-γ水平 灌肠10 d结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h，称重后予10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，股动脉取血4 mL置于无菌干燥采血管中，室温静置分层后，4 ℃低温离心10 min(2 500 r/min)提取血清，保存于-20 ℃冰箱。按试剂盒说明采用ELISA法检测：预先采用IL-1β、IFN-γ单抗包被于酶标板上，加入生物素抗大鼠 IL-1β/IFN-γ抗体，样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS 洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液硫酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪测定OD值，通过绘制标准曲线得出样本中IL1-β、IFN-γ的浓度， IL-1β/IFN-γ浓度与吸光值呈正相关。

1.6.3结肠大体损伤指数(CMDI) 采血后采用颈椎脱臼法处死大鼠，取全结肠沿肠系膜纵轴剖开，PBS缓冲液冲洗干净，肉眼下观察黏膜损伤状态，测量溃疡面积，根据结肠黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡、坏死等情况进行评分。0分：结肠无损伤；1分：结肠轻度充血、水肿，表面光滑；2分：结肠明显充血水肿,黏膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠粘连；3分：高度充血水肿，黏膜表面溃疡形成,溃疡最大纵径<1.0 cm；4分：在3分基础上溃疡最大纵径>1.0 cm，或全肠壁坏死。

1.6.4结肠组织学观察及组织学损伤指数(TDI)选取黏膜损伤明显处大小约1 cm×1 cm、厚度约3 mm的结肠组织，4%多聚甲醛固定后，将组织在流动水下冲洗20 min，置于不同浓度的乙醇溶液中脱水，石蜡包埋组织，切片(厚度3 μm)，苏木素-伊红染色，乙醇溶液中脱水，再经二甲苯使切片透明，用中性树胶封片，根据镜下组织学评分标准进行光镜下镜检和评分。TDI评分包括2部分：上皮细胞形态正常记0分，有杯状细胞丢失记1分，杯状细胞大面积丢失记2分，隐窝细胞丢失记3分，隐窝细胞大面积丢失记4分；炎细胞浸润无记0分，浸润在隐窝基底层记1分，浸润到达黏膜肌层记2分，浸润深入到黏膜肌层伴黏膜增厚和明显水肿记3分，浸润到达黏膜下层记4分。

1.7统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若两项检验均符合，多个样本组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况及DAI评分比较 空白组大鼠活动灵活，反应敏捷，饮食及大便正常，皮毛光滑，体重自然增加；模型组大鼠逐渐出现懒动、嗜睡、反应迟钝，皮毛干枯无光，饮水及进食量减少，大便带血或脓血便，体重明显减轻。化瘀通阳方组和美沙拉嗪灌组大鼠在灌肠10 d后精神逐渐恢复，活动增加，饮食量渐增，大便性状改善，隐血消失。模型组大鼠造模第7天和灌肠干预第10天DAI评分均高于空白组(P均<0.05)，化瘀通阳方组和美沙拉嗪灌组均明显低于模型组(P均<0.05)，化瘀通阳方组与美沙拉嗪组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模第7天和灌肠第10天DAI评分比较分)

2.2各组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比较模型组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平均明显高于空白组(P均<0.05)，美沙拉嗪组与化瘀通阳方组均明显低于模型组(P均<0.05)，化瘀通阳方组与美沙拉嗪组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比较

2.3各组大鼠结肠黏膜组织大体及HE染色表现空白组大鼠解剖后结肠黏膜正常；模型组大鼠结肠黏膜色暗，肠管呈现不同程度的充血和水肿，肠壁黏膜散在溃疡灶，周边充血或糜烂；化瘀通阳方组和美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜存在轻度的充血水肿，可见溃疡愈合的瘢痕，溃疡周围黏膜未见明显充血水肿。

病理切片HE染色可见空白组大鼠结肠黏膜结构清晰，杯状细胞丰富，无炎细胞浸润，见图1；模型组大鼠可见黏膜固有层腺体结构被破坏，杯状细胞大量丢失，炎性细胞广泛浸润达到黏膜下层，见图2；化瘀通阳方组和美沙拉嗪组大鼠可见局部上皮修复和腺体不同程度的改善，炎细胞浸润面积明显减少，见图3和图4。

图1 正常组大鼠结肠黏膜组织HE染色表现(×400)

图2 模型组大鼠结肠黏膜组织HE染色表现(×400)

图3 美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜组织HE染色表现(×400)

图4 化瘀通阳方组大鼠结肠黏膜组织HE染色表现(×400)

2.4各组大鼠结肠黏膜组织CMDI评分与TDI评分比较 模型组大鼠结肠黏膜组织CMDI评分与TDI评分均明显高于空白组(P均<0.05)，美沙拉嗪组与化瘀通阳方组均明显低于模型组(P均<0.05)，化瘀通阳方组与美沙拉嗪组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠结肠黏膜组织CMDI评分与TDI评分比较分)

3 讨 论

溃疡性结肠炎是一种反复发作的慢性炎症性疾病，其发病机制涉及遗传易感性、环境和免疫反应等多方面。上皮屏障功能受损打开了免疫反应的第一道防线，共生细菌和微生物产物从肠腔经上皮层进入固有层，启动宿主免疫反应，导致免疫细胞的激活和细胞因子的产生。细胞因子作为信号分子参与细胞激活和分化等多种生物学过程，不仅推动肠道炎症进展，还可调节溃疡性结肠炎的肠外表现和全身效应。根据细胞因子在介导炎症反应中的不同作用分为促炎细胞因子、抗炎细胞因子两种类型。本研究测定的IL-1β是促炎细胞因子IL-1的主要循环形式，涉及广谱的炎性疾病，其表达、激活及分泌主要与单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等天然免疫细胞亚群相关[9]。在炎症性肠病中，IL-1β能够通过募集粒细胞和激活CD4+T细胞，增加IL-17A、IL-12、IFN-γ等促炎因子的产生，加重肠道炎症[10-11]。Mao等[12]研究表明，肠固有层中的IL-1β能与IL-6协同作用，诱导幼稚T细胞分化为Th17 T细胞(分泌IL-17)或下游的T细胞(分泌IFN-γ)，共同介导肠固有层的炎症变化。IFN-γ作为Ⅱ型干扰素的唯一成员也是常见的促炎性细胞因子，主要由自然杀伤细胞(NK)及辅助性T细胞(Th1)产生。在机体的固有免疫中，IFN-γ是巨噬细胞、中性粒细胞及NK细胞重要的募集激活剂，可促进Ⅱ型主要组织相容性复合物(MHCⅡ)的表达，促进Th1细胞分化，抑制Th2细胞活化与增殖，从而参与体内的炎症反应[13-14]。另有研究表明IFN-γ能与TNF-α协同作用，通过刺激基质金属蛋白酶的表达、诱导一氧化氮的合成而对结肠黏膜产生损害[15]。

溃疡性结肠炎属中医“泄泻”“肠澼”“痢疾”“肠风”等范畴，多数医家认为素体脾虚是溃疡性结肠炎的发病基础，湿邪(热)、瘀热、热毒、痰浊、气滞、血瘀等为常见病理因素。卫气来源于脾胃运化所生的水谷精微，是人体阳气的一部分，故又称为“卫阳”。本课题组前期理论研究认为卫气慓疾滑利、游窜迅速，主管人体防御功能，与西医免疫细胞的分布循行和免疫功能非常相似。肠道中的免疫细胞分布于黏膜及黏膜下层，执行免疫防御、免疫监视的功能。若卫气郁痹，卫阳失宣，人体抵御病邪的能力减弱，无以固护肠道，卫不偕营，营卫交会生化失常，营血不能得到有序的气化温通，阻滞脉道，损伤肠络，久则气滞血涩，血滞为瘀。因此，导师基于中西医理论认为卫阳郁滞、瘀阻肠络是溃疡性结肠炎的关键病机，针对此病机，施丽婕教授自拟化瘀通阳方，方中薤白温通卫阳、理气散结，五灵脂与蒲黄相须为用化瘀止血、活血止痛，三药合用，共奏温通散结、化瘀止痛之功。现代药理学研究表明，薤白中分离的皂苷类化合物Macrostemonoside F有明显的抗炎活性，可通过增强吞噬细胞活性提高小鼠的免疫功能[16-17]；五灵脂活血化瘀,胡小松等[18]测定了五灵脂的菌群及丰度，表明厚壁菌门、拟杆菌门占优势地位，且存在较高丰度的产短链脂肪酸相关菌，有益于肠道健康；蒲黄具有化瘀止血作用，蒲黄醇提液对小鼠化学刺激和物理刺激致痛都有明显的镇痛作用，大剂量蒲黄可增强巨噬细胞功能，提高小鼠的体液免疫和细胞免疫功能[19]。

本研究利用5%DSS溶液成功制备溃疡性结肠炎大鼠模型，经化瘀通阳方干预后，溃疡性结肠炎大鼠体重、精神状态、进食量、皮毛及粪便性状等均得到显著改善，镜下观察结肠黏膜损伤好转，血清中IL-1β、IFN-γ水平显著降低。提示化瘀通阳方可能通过减少IL-1β、IFN-γ等促炎因子的表达，从而减轻结肠黏膜的炎症，修复肠组织损伤，对溃疡性结肠炎起到较好的治疗作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。