血清miR-34a水平与阿尔茨海默病及认知功能障碍的相关性

张誓伟 赵杰菲 贺显君 乔 莹 睢志向 宋 彦

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，主要临床表现为记忆力下降、认知功能障碍、精神行为异常及人格改变等，严重影响患者的生活。由于AD发病机制复杂，影响因素众多，目前对于AD的早期预防和诊疗尚无理想方法[1]。然而，随着对AD发病的家族性聚集情况的研究，遗传及基因研究逐渐受到人们的关注。miRNA是一种能够调控蛋白表达的小分子单链RNA，参与胚胎发育、机体免疫、肿瘤形成以及血管性疾病的发生发展，并参与神经系统发育和神经元分化过程[2]。有研究发现在血管性痴呆患者血清中miR-34a水平高于对照组，并随着痴呆程度的加重升高[3]；抑制AD转基因小鼠中miR-34a的表达可显著改善其焦虑障碍行为表现[4]。但目前关于血清中miR-34a水平与AD及认知功能障碍的相关性研究尚不多见，本研究通过比较miR-34a在AD、轻度认知障碍(Mild cognitive impairment，MCI)及健康老人中的水平差异，探讨miR-34a水平与AD和认知功能障碍的相关性。

1.资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年10月至2020年1月本院收治的AD患者60例，其中男性28例，女性32例，平均(72.63±3.03)岁；同期收集MCI患者60例，男性31例，女性29例，平均(72.4±2.89)岁。AD和MCI组纳入标准：①AD符合《精神障碍诊断与统计手册》中关于AD的诊断标准，MCI符合Petersen修订的关于MCI的诊断[5,6]；②年龄≥65岁；③临床表现和实验室检查提示无脑梗死、脑出血及颅内占位等可能引起认知障碍的疾病。排除标准：①严重肝、肾、心功能不全者；②病例资料不全者；③有听觉及意识障碍等不能接受认知功能检测者；④既往有精神病史或已使用过治疗痴呆药物者。选择同期来我院体检的健康老年人(年龄≥65岁)60例作为对照组，男性36例，女性24例，平均(72.18±3.11)岁。本研究经本院伦理委员会审核批准，且所有受试者或其家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR检测血清miR-34a水平：抽取受试者清晨空腹状态下的外周静脉血5ml，离心、收集上层血清，按照Trizol试剂盒(Invitrogen)提取血清总miRNA；采用RT-PCR逆转录试剂盒(Invitrogen)将RNA逆转录为cDNA；以cDNA为模板，qRT-PCR检测miR-34a水平。以U6为内参，反应体系为15μl，设置PCR仪器参数为95℃、2min、40个循环，93℃、15s、30个循环，70℃、1min、30个循环。并利用CFX manager 3.0软件对Ct值进行分析，在通过2-ΔCt法计算miR-34a的相对表达量(ΔCt=CTmiRNA-CTU6)。

1.2.2 认知功能及其他临床指标检测：对受试者采用简易精神状态检查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)进行评定，分别从定向力、记忆力、注意力、计算力、回忆力及语言表达等几个方面进行评定，分值越高表示认知功能越好。两种量表的总分均为30分，MMSE得分≤24分、MoCA得分≤26分为存在认知功能障碍。评估在安静环境下进行。

受试者血液样本抗凝状态下送检验科，采用AU5800全自动生化分析仪(迈瑞)检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海酶联)检测同型半胱氨酸(Hcy)水平，按照试剂盒说明进行操作，测定其在450nm处OD值，并根据OD值计算Hcy水平。

2.结果

2.1 三组一般及临床资料比较 三组受试者受教育水平、高血脂、TG、TC、LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA评分均有统计学差异(P<0.05)；两两比较显示，MCI和AD组患者血清TG、TC、LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA评分均高于対照组，且AD组LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA评分高于MCI组(P>0.05)。见表1。

表1 三组一般及临床资料比较

表2 miR-34a水平与临床指标的相关性分析

2.2 miR-34a表达水平比较及其与临床指标的相关性 三组miR-34a表达水平比较发现：AD组(3.27±0.74)和MCI组(2.49±0.76)miR-34a的相对表达水平均显著高于对照组(1.27±0.20)，且AD组显著高于MCI组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。为探讨miR-34a的表达水平与临床指标的相关性，进一步的相关性分析，结果显示：血清miR-34a水平与Hcy、TG、TC水平成正相关；与MMSE、MoCA评分成负相关(P<0.05)。

2.3 miR-34a诊断性能分析 分别以对照组vsMCI组、MCI组vsAD组为因变量，以miR-34a和表1中有差异的指标为自变量分别进行多因素Logistic回归分析，其中连续变量根据中位数转化为二分类变量，结果显示miR-34a可能是轻度认知障碍发生、轻度认知障碍进展为AD的独立危险因素(P<0.05)，见表3和表4。以miR-34a为自变量进行不同组别下的ROC曲线分析，结果显示miR-34a诊断认知功能障碍总体、轻度认知功能障碍及鉴别MCI和AD的性能均较好(AUC>0.7)，见图1和表5。

图1 miR-34a诊断AD及MCI的ROC曲线

表3 MCI的影响因素分析

表4 MCI进展为AD的影响因素分析

表5 miR-34a诊断AD及MCI的ROC曲线参数

3.讨论

随着人口老龄化的加剧，AD患者人数逐年攀高。目前对于AD患者的诊疗方法主要是影像学、脑电图及脑脊液检查测等，但这些检测方法的诊断特异性和敏感度仍不够理想[7]。近年来，相关学者提出AD的发生可能与基因遗传学有关，寻找特异性基因或RNA用于临床辅助诊断有望提高AD诊断的效率[8]。据报道，在脑组织中约20%～40%的miRNA参与大脑的发育过程，且越来越多的研究发现多种miRNA与神经退行性疾病进展密切相关[9]。miR-34a是miR-34家族的重要成员，单独位于染色体1p36上，并参与多种生物学功能。在发育过程中，它参与调控神经干细胞的增殖、分化，神经元成熟和凋亡等神经发育的各个方面；在衰老过程中，miR-34a的升高与听力丧失和老年性黄斑变性有关；在病理上，它的升高可能导致癫痫发作和缺血性中风时的神经损伤和死亡，抑制miR-34a的表达可提高神经退行性疾病中多种神经毒性神经细胞的存活率，可能起到神经保护作用。有研究发现miR-34a在AD模型小鼠中过表达，且与小鼠记忆、学习能力受损有关，抑制miR-34a表达后小鼠的记忆障碍明显减弱，推测其可能参与早期AD的发展[10]。也有研究表明miR-34a过表达可导致突触可塑性、能量代谢和静息状态网络活性的功能障碍，导致快速而深刻的记忆、执行能力等认知障碍和AD神经病理进展，提示miR-34a可能是AD的潜在治疗靶点[11,12]。本研究结果发现AD患者血清中miR-34a水平显著高于对照组和MCI组，且与精神状态评分和认知功能评分均成负相关。

ROC曲线分析和Logistic回归分析结果显示，在排除了其他因素的干扰后，miR-34a是认知功能障碍和轻度认知障碍进展为AD的独立影响因素，与现有研究结果基本一致。另外，已有研究证实AD的发病与Hcy和血脂水平密切有关，Hcy会降低人体抗氧化和甲基化能力，导致认知功能的减退，促进轻度认知功能障碍向AD的演变，而降低Hcy和LDL-C、TC等血脂水平则可延缓AD的进展[13,14]。本研究结果发现MCI和AD组LDL-C、Hcy、TG和TC水平均显著高于对照组，且miR-34a与Hcy、TG和TC水平均成正相关，提示miR-34a可能通过血脂代谢等参与患者认知功能障碍的病理进程。

综上所述，本研究认为miR-34a在AD患者血清中高表达，且是AD和认知功能障碍的独立危险因素，具有一定的临床诊断价值，可能成为AD治疗的潜在分子靶点，但miR-34a的确切作用和机制还需深入研究。