利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术研究斑马鱼响应富营养化污染水质内源性脂质分子变化

张雅文，秦 亮，陈路路，王晓东,2*

(1.中央民族大学生命与环境科学学院,北京 100081；2.生物成像与系统生物学研究中心，北京 100081)

水体富营养化是水中氮、磷等营养物质含量积累过多而引起的一种水质污染现象[1-3]。在水体富营养化情况下，藻类的快速繁殖往往致使水体透明度下降，显著影响其他水生植物光合作用效率，易造成水中溶解氧的异常，进而导致水生生物大量死亡[4-5]。水体富营养化不仅影响人类饮用、农田灌溉、畜牧养殖的用水质量，而且也容易造成水体生态系统功能失衡[4，6]。已有研究报道，随着降水类型变化和化学肥料的广泛应用，预计在中国东部可能会出现更严重的富营养化现象[7]。考虑到未来水质污染变化，在水资源短缺的形势下监测富营养化情况，构建生态环保、绿色、高效的水质污染检验、监测和评价方法至关重要。水生生物与水体环境之间具有直接交互影响的特点，水生生物的生理生化变化一定程度上可以直接反应水质环境的变化情况。因此，从生理学角度上，利用对于水环境变化敏感的水生生物研究其响应富营养化污染水质时内源性分子变化规律对于探究并建立新型、绿色、高效水体质量监测方法与分析策略具有现实意义。

斑马鱼(Zebrafish)属于鲤科鱼丹属脊椎动物，由于其个体较小(成熟体长4～6 cm)，繁殖周期短，对外源分子处理具有敏感性，并且其基因与人类高度相似(相似度高达到 87%)，因而常被作为一种模式物种应用于诸多研究领域，例如生物学、基础医学、药学、神经科学等[8-11]。许多研究表明斑马鱼对于外源污染物具有明显的生物富集效应，因此其也被广泛应用于环境科学研究，如常被用于农药、化学肥料、重金属污染水质的监测与评估[12-14]。截至目前，尽管基于斑马鱼开展的污染水质毒理学研究取得了众多进展[15-16]，但是仍缺乏斑马鱼应对水质污染时其内源性脂质分子变化规律的研究。众所周知，生物体内的脂质分子在信号转导、质膜组成、物质运输及能量储存等诸多方面均发挥重要作用。研究表明脂质代谢失衡与生物体应对外界环境胁迫密切相关[17-18]。因此，准确、全面、系统地获取斑马鱼响应富营养化水质污染时体内关键脂质分子变化及原位空间分布信息，对于进一步理解该物种应对外界富营养化水质污染胁迫时的脂质分子响应机制至关重要。目前用于研究生物体内脂质分子常用方法主要包括系统溶剂分离技术[19]、薄层色谱(thin-layer chromatography,TLC)[20]、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)[21]、气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[22-23]、液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-MS,LC-MS)[24-26]等。通常情况下，为了保证这些方法对于脂质分子的有效分析效能，首先需要完成对生物样品中内源性脂质分子的分离提取。然而，这些分离提取方法复杂而烦琐的操作程序，不可避免地增加了脂质分子结构改变的风险(如体外氧化)[27]，而且无法获得生物体响应生物与非生物胁迫时内源性脂质分子变化的原位信息。显然，对于生物组织内部脂质分子真实结构特征及原位分布情况的全面、直观解读对于深刻理解生物体内源性脂质分子应对环境胁迫作用机制至关重要。质谱成像(MS imaging,MSI)作为一种新型分子影像技术，可在整体、组织或细胞水平上同时表征样本表面多种分子组成、结构、丰度及原位空间分布信息[28-30]。近年来，随着该技术的不断发展与完善，已被广泛应用于基础医学、药物学、微生物学、动植物科学等诸多前沿研究领域[31-33]。

现运用新型基质辅助激光解吸电离质谱成像(matrix assisted laser desorption ionization MS Imaging,MALDI-MSI)技术，从生物内源性脂质代谢分子角度出发，针对环境敏感型模式物种斑马鱼应对富营养化污染水质胁迫后内源性脂质分子表达与分布的变化进行整体动物原位研究，以期初步揭示富营养化污染水质斑马鱼脂质分子响应机制，为水体质量监测与评价新型分析策略的建立奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

质谱纯甲醇(methanol)、甲酸(formic acid,FA)、乙醇(C2H5OH)、硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)、抗坏血酸(C6H8O6)、钼酸铵(H8MoN2O4)、氢氧化钠(NaOH)、过硫酸钾(K2S2O8)、盐酸(HCl)、硝酸钾(KNO3)、三氯甲烷(CHCl3)、高锰酸钾(KMnO4)、草酸钠(C2Na2O4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、碳酸镁(MgCO3)、酚酞(phenolphthalein)、丙酮(acetone)、2-巯基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole,2-MBT)均购于Sigma-Aldrich公司；peptide standard II标准溶液购于德国Bruker Daltonics公司；实验用水为超纯水(Milli-Q H2O,美国Millipore公司)。

基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(Autoflex Speed MALDI time-of-fight(TOF)/TOF mass spectrometer)购于德国Bruker Daltonics公司，该仪器配备Nd:YAG脉冲式紫外激光器(激光波长为355 nm)；铟氧化锡(indium tin oxide,ITO)包被导电载玻片及基质喷涂装置(ImagePrep)均购于德国Bruker Daltonics公司；徕卡CM1860冷冻切片机购于德国Leica Microsystems公司；电子天平购于瑞士Mettler Toledo公司；Thermo Mixer C混匀仪购于德国Eppendorf公司；爱普生V-550平板扫描仪购于美国Epson公司等。

1.2 富营养化水体体系模拟

1.2.1 富营养化水体材料

为使实验模拟更符合实际，实验结果更具有代表意义，供试水取自北京某大学一小型湖泊(116° 19′0.14″E，40° 0′2.38″N)中部水层。利用有机玻璃采水器采集水面20 cm以下的水样，获得后去除水中明显杂物，避光保存。同时为保证水样富营养化程度，使用抓斗式采泥器采集湖塘表层10 cm厚的底泥。

1.2.2 水体富营养化程度测试

确认供试水的富营养化程度。按照相关性、可操作性、简洁性和科学性相结合的原则，从影响湖泊富营养化的众多因子中选取总氮(total nitrogen,TN)、总磷(total phosphorus,TP)、叶绿素a(chlorophyll a,Chl.a)、透明度(transparency,SD)、高锰酸盐指数(chemical oxygen demand of Mn,CODMn)共5项指标作为富营养化评价的统一指标。利用综合营养指数法(comprehensive trophic level index,TLI)对供试水的富营养化程度进行评价。

根据GB11894—89，使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定水中总氮质量浓度；根据GB11893—89，使用钼酸铵分光光度法测定水中总磷质量浓度；根据GB11892—89，使用重铬酸盐法测定水中高锰酸盐质量浓度；根据《水和废水监测分析方法》第四版，使用塞氏盘法测定透明度，使用分光光度法测定叶绿素a含量。

综合营养状态指数公式为

式中：TLI(∑)为综合营养状态指数；TLI(j)为第j种参数的营养状态指数；Wj为第j种参数的营养状态指数的相关权重；m为评价参数个数。采用0～100的一系列连续数字对营养状态进行分级：综合营养状态指数 ≤30为贫营养；30＜综合营养状态指数≤50为中营养；综合营养状态指数>50为富营养；50＜综合营养状态指数≤6为轻度富营养化；60＜综合营养状态指数≤70为中度富营养化；综合营养状态指数>70为重度富营养化。

1.3 斑马鱼实验样本收集与培养

成年斑马鱼购于北京花鸟市场，鱼龄120 d左右，平均体长为(3.5±0.5)cm。正式实验前将其在水温(26±1)℃，pH为7.5±0.5，光照周期14 h，光照/10 h黑暗条件下进行驯化饲养14 d。每天喂食丰年虫(Artemia nauplii)2次，粪便和未食用的食物每天清理一次；每天置换50%培养水体。在驯养期间，所有斑马鱼健康，死亡率＜2%。

取实验组和对照组水缸，长×宽×高规格为40 cm×30 cm×25 cm，有效水深16.5 cm。实验组水缸注入供试富营养化水，对照组水缸只注入正常无污染水。根据经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)测试准则，在满足实验样本基本数量(n>7)和水缸大小的前提下，分别将30条成年斑马鱼在实验组与对照组水缸中暴露96 h，并在24 h、48 h、72 h和96 h记录斑马鱼的死亡率。

1.4 MALDI MS实验样本前处理

实验组与对照组分别培养96 h后，选取两组的斑马鱼(均体长约4.5 cm)置于模具中，放入-80 ℃冷冻致死6 h，然后开展质谱成像实验。具体实验步骤如下：首先用徕卡CM1860冷冻切片机对其进行低温切片，取连续组织切片(厚度为10 μm)转移至ITO导电玻片导电面，在室温下干燥15 min；然后对相应组织切片进行形态扫描以获得高清光学组织图像，用以后续质谱成像采集区域矫正与标定；随后将基质化合物2-MBT 溶于混合MeOH/H2O/FA(80∶18∶2,v/v/v)溶液中，最终配置成2-MBT浓度为 12 mg/mL的基质溶液；进而将该溶液导入至基质喷涂装置ImagePrep完成对组织切片40个周期的基质喷涂(每个周期包括：2 s喷雾，30 s孵育，60 s干燥时间)。在进入质谱仪器分析前，对基质包被的组织切片进行二次干燥处理，待干燥充分后装靶导入质谱进行数据采集。

1.5 质谱成像及数据处理

质谱成像采用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS,德国Bruker Daltonics公司)，以正离子反射模式获得数据。成像分辨率为100 μm，激光能量强度为80%，设定数据采集的质量范围为m/z500～1 000，并使用peptide standard II标准溶液(德国Bruker Daltonics公司)进行质量校准。通过Bruker MALDI-TOF/TOF MS碰撞诱导解离(collision-induced dissociation,CID)离子碎裂方式采集MS/MS数据(碰撞诱导碎裂能量设置为19 keV)，将检测到代谢物的特征片段离子，与数据库中一级和二级代谢物进行匹配鉴定。数据处理采用FlexAnalysis软件(v.3.4版本,德国Bruker Daltonics公司)对MALDI-MS数据进行查看和处理等，成像数据使用FlexImaging软件(v.4.1版本,德国Bruker Daltonics公司)对质谱成像数据进行重构。

在MetaboAnalyst 4.0平台(https://www.metaboanalyst.ca/)上对采集的质谱数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘回归分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)，以确定对照组和实验组是否具有统计学差异。通过与代谢物数据库METLIN(https://metlin.scripps.edu/)和LIPID MAPS(https://www.lipidmaps.org/)匹配一级和二级信息鉴定代谢物(ppm＜10，ppm表示百万分率，ppm=|(实际分子量-理论分子量)|/理论分子量×106)。在正离子模式下数据库匹配时，囊括了以下三种加合离子形式：[M+H]+、[M+Na]+及[M+K]+进行检索。

2 结果与讨论

2.1 水质营养状态评价

通过测量总氮、总磷、叶绿素a、透明度、高锰酸盐指数指标，并利用综合营养指数法(TLI)对供试水的富营养化程度进行评价。结果如表1所示，供试水的综合营养指数为57.14，经过与分级标准进行对比，确定供试水的营养程度为轻度富营养化。

2.2 富营养化水质影响斑马鱼代谢差异分析

斑马鱼经过富营养化污染水质胁迫96 h后，利用MALDI-MS技术，在相同条件下对实验组(随机选取3条，n=3)与对照组(随机选取3条，n=3)斑马鱼体内代谢物进行总体分子轮廓检测，其中实验组共检测到106个信号峰，对照组48个信号峰。如图1所示，富营养化水质处理组与未处理组斑马鱼对比发现有超过50%原位检测的代谢分子存在显著表达差异。进一步对实验组与对照组分子信号数据进行t检验(Student’sttest)，分析发现实验组与对照组数据具有极显著差异(p＜0.000 1)。实验结果表明，富营养水质对斑马鱼造成胁迫，导致斑马鱼体内代谢急剧变化，相关代谢分子种类及含量的变化与斑马鱼响应胁迫机制密切相关。

为了进一步避免本实验结果的偶然性，将实验组和对照组平行检测个体实验从3条增加至9条。即，实验组在富营养化水质处理96 h后的30条斑马鱼中随机选取9条(体长约4.5 cm)，对照组在未处理组的30条斑马鱼随机选取9条(体长约4.5 cm)进行平行对比MALDI-MS实验。结果如图2(a)所示，相关性分析揭示实验组与对照组斑马鱼内源性分子间存在明显差异，实验组组内相关性相对较弱，对照组组内相关性相对较强。该结果表明：斑马鱼在应对富营养化胁迫时个体间存在一定主成分1差异，但并不影响区分组间差异。利用无监督主成分分析(principal components analysis,PCA)和有监督偏最小二乘回归分析法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)对富营养化污染水质胁迫斑马鱼和对照组MALDI-MS数据进行统计分析。PCA得分图显示在主成分1(the first principal component，PC1)(98.7%)和主成分2(the second principal component，PC2)(0.9%)轴上，富营养化水质实验组和对照组之间存在明显的分离。如图2(b)(PCA)、图2(c)(PLS-DA)所示，对照组组内分布较为集中，而实验组组内分布较为离散，说明未处理组斑马鱼个体之间内源性分子表达差异较小，而暴露在富营养化水质96 h后斑马鱼个体之间代谢分子表达差异较大。实验结果充分表明实验组斑马鱼个体之间内源性分子表达较大的离散度与其生活的富营养化水质条件密切相关。因此，可以猜测其中的原因可能是由于富营养水质胁迫下斑马鱼个体间出现了一定的代谢异常从而增大了个体间代谢水平的异质性，进而出现了在相同胁迫条件下不同个体之间的响应情况和程度的差异性。尽管如此，两种统计学分析方法均能将实验组与对照组明显的分成两簇，足以说明富营养化污染水质胁迫实验组斑马鱼与未处理组斑马鱼体内内源性化合物存在显著表达差异。

表1 实验组水质富营养化情况统计表Table 1 Evaluation of eutrophication for experimental group water

实验组：富营养化水质培养的斑马鱼；对照组：正常水质培养的斑马鱼；****为极显著差异；p＜0.000 1图1 斑马鱼内源性代谢分子MALDI-MS原位正离子模式检测及t检验分析Fig.1 Comparison of metabolites in-situ detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode and t-testing

皮尔逊相关系数(PCC)为1时表示变量完全正相关，0时表示无关，-1时表示完全负相关；主成分(PC1)是方差最大的变量的线性组合(在所有线性组合中),其解释了数据中尽可能多的变化;主成分2(PC2)尽可能多地解释剩余的变化，其约束条件是第一个和第二个成分之间的相关性为0。PC1和PC2的累积贡献率越大表示斑马鱼实验组与对照组代谢组差异越大图2 斑马鱼实验组与对照组代谢差异分析Fig.2 Difference analysis of metabolites in zebrafishes between eutrophication group and control group

为了进一步探究主要差异代谢分子的变化及其功能作用，利用PLS-DA进行变量投影重要性(variable importance of projection,VIP)分析(化合物VIP值越大，其对于区分各组样品的贡献度越大)筛选用于区分实验组与对照组斑马鱼贡献度大代谢分子，并对VIP值排名靠前的主要代谢化合物(VIP>1)进行鉴定分析，具体结果如表2所示。可以发现，一共分析筛选出了10种差异代谢分子，鉴定结果表明，这些分子主要属于磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines,PCs)及磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)两类磷脂类化合物，具体分子类型如下：PC(32∶0)、PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(36∶0)、PC(38∶6)、PC(40∶6)、PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)、PE(40∶9)。磷脂是生物膜的重要组成成分，作为膜的结构和功能单位，磷脂以其规律的结构保证细胞的正常形态和功能，如生长、繁殖、细胞识别与消除、细胞间信息传递、细胞防御、能量转换等功能[34-35]。因此在富营养化水质中暴露96 h后斑马鱼体内磷脂表达水平的变化可能是为了应对富营养化水质对机体的不利影响，而发生的自我适应反应。

2.3 富营养化水质影响斑马鱼内源性脂质分子原位表征分析

现利用MALDI-MSI原位分析实验组与对照组斑马鱼体内脂质代谢分子的变化信息，更直接地观察富营养化污染水质对斑马鱼内源性代谢物的影响。在正离子检测模式下，重构了富营养化水质培养的斑马鱼和未处理组斑马鱼体内主要脂质代谢物原位的质谱成像图，如图3所示，质谱成像信号主要由磷脂类组成，颜色越鲜亮表示相应磷脂在该检测部位的相对含量越高。对比整体斑马鱼质谱成像图发现不同的磷脂类代谢物在斑马鱼整体组织切片上的分布具有明显组织特异性。根据已鉴定出的斑马鱼中的磷脂类物质在组织切片中质谱成像颜色亮度的深浅，可知斑马鱼体内的磷脂含量总体上实验组高于对照组，且在斑马鱼切片各部分呈现出明显的组织特异性分布差异。因此，在富营养化水质的胁迫下，环境中更多的N、P营养元素容易进入斑马鱼体内从而影响起其体内脂质代谢情况，一定程度上可以改变体内磷脂类化合物的表达水平。此外，富营养化造成的水质条件的改变，如溶解氧的下降，也会对斑马鱼体内正常代谢造成影响。

表2 富营养化水质胁迫下斑马鱼与正常对照组相比主要差异脂质分子鉴定信息(VIP>1)Table 2 Identification of differential lipids(VIP>1)detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode

PC为磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine),PE为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)图3 实验组与对照组斑马鱼主要差异脂质分子质谱成像图Fig.3 Images of differential lipids(VIP>1)detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode

磷脂酰胆碱(PCs)广泛存在于动物体内，是磷脂类分子主要成分之一，生物体多种生理生化代谢活动均与其密切相关。研究表明PCs的积累有助于有促进神经传导、提高脑部信号交互活力、增强机体抗病变及抗氧化能力、活化血管降低血脂、延缓机体衰老及改善膜磷脂组分增加膜流动性和膜酶活性等[36-41]。富营养化胁迫的斑马鱼与正常水质斑马鱼体内主要差异PCs分子质谱成像结果如图3所示。可以发现实验组斑马鱼体内差异PCs分子表达水平明显高于对照组，表明斑马鱼受到富营养化胁迫时体内磷脂酰胆碱代谢出现了异常，推测与其应对外界刺激、维护机体正常生命活动有关。这些主要差异PCs分子具体组织特异性分布情况如下：PC(34∶1)主要集中在头部、眼部及躯干背部分布，实验组该磷脂分子的表达量明显高于对照组，推测该分子的高表达可能与提高机体活力及反应力有关。PC(40∶6)主要集中在鱼眼位置分布，其中实验组中该分子集中分布在鱼眼外周，而在对照组中则集中分布在鱼眼内部区域，暗示该磷脂分子的这种互补差异分布与斑马鱼眼睛感知周围水生环境变化密切相关，显然富营养化水体浊度明显高于正常水体，且两组水体之间水中所含物质组成也有明显不同，在一定程度上会引起水体渗透压的改变；因此可以推测PC(40∶6)分子的差异表达与斑马鱼眼部器官应对外界环境的变化存在一定相关性。PC(32∶0)在实验组中主要分布在鱼鳃及腹腔区域，而在对照组中则集中分布在腹腔及鱼尾与鱼身交界区域；PC(38∶6)在实验组中集中在鱼鳃、腹腔及躯干背部尾部区域高表达；此外，PC(34∶2)与PC(36∶0)在实验组与对照组中具有类似的分布情况，主要集中在斑马鱼躯干区域分布，两组之间最大区别在于两种磷脂分子表达量实验组明显高于对照组。鱼鳃是鱼类与水环境进行物质交换的重要枢纽之一，在鱼类免疫力异常情况下，环境中的有害物质易通过该器官进入斑马鱼体内，进而影响其众多生理生化活动。PCs在鱼鳃和靠近鱼鳃附近区域的积累，说明应对富营养化水质时，斑马鱼积累更多的PCs可能与改善、活化鱼鳃生物学功能有关[42]。腹腔PCs分子的差异表达可以一定程度上反映斑马鱼应对富营养化污染时腹腔生理活动能力的改变。躯干部分是鱼类综合活动正常执行的主要载体，本研究发现短时间水体富营养化胁迫并没有造成斑马鱼活动能力的明显异常；因此，斑马鱼躯干区域PCs分子的差异表达在一定程度上与斑马鱼应对富营养化胁迫、抵御不利影响存在相关性，也进一步证明了PCs分子的积累有助于提高生物体抗病变能力[43]，与之相关的精确分子作用机制仍需进一步研究。

磷脂酰乙醇胺(PEs)是一类广泛存在于生物体中且含量仅次于PCs的磷脂分子，是合成其他甘油磷脂类分子的重要中间体，并且研究表明PEs在细胞自噬、细胞分裂、蛋白质折叠、蛋白质修饰前体的合成等多种生命活动中均发挥着重要作用[44-45]。例如，MALDI-MSI成像图3所示，PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)及PE(40∶9)在富营养化水质处理的斑马鱼中分子表达明显上调且其分布的组织特异性较上述差异PCs分子要低，表明同种PE分子可能参与了众多组织或器官的多种生理生化活动，一定程度上证明了PEs分子具有多样的生物学功能[46-47]。基于本实验的研究结果可以推测当富营养化水质对斑马鱼机体产生胁迫时，体内不同区域PEs的积累可能与斑马鱼自身细胞损伤修复或凋亡、错误折叠蛋白降解、受损细胞器清理等生理生化过程密切相关。在未来的研究中将开展更多的实验，以期进一步揭示PEs分子在斑马鱼响应富营养化胁迫时精确分子作用机制。

已有研究表明水体富营养化会严重影响鱼类体内的代谢过程[4]，研究结果进一步证明了这一结论，实验结果表明斑马鱼受富营养化水质影响其体内的代谢分子(特别是磷脂分子)会出现不同程度异常表达。有研究表明，氮、磷等营养因子在低浓度时可作为水体中鱼类的饵料资源，一定程度上可形成鱼类的生存有利环境，从而有助于提高鱼类产量[48-49]。然而，当这些营养元素浓度超过一定限度时容易诱发水体富营养化污染，从而使得这些营养成分成为了水生生物生存负面环境因子的诱因，比如水中过高的N、P元素浓度容易促使喜氧浮游生物的过度繁殖，而进一步造成水体溶解氧含量的显著下降、水中氨含量超标等[50]。水环境中的氨增加，抑制了鱼类自身氨的排出，使血液和组织中氨的浓度升高，容易引起鱼类直接中毒并出现呼吸困难、分泌物增多等一系列生理反应；水中溶解氧的降低，易造成鱼类呼吸成本的上升，而引起鱼类异常的生理生化反应。然而对于鱼类应对水体富营养化污染时出现的上述多种生理生化异常现象一直缺少分子层面的直观可视化研究，本文实验的开展一定程度上弥补了这一不足，MALDI-MSI结果直接证明了斑马鱼体内脂质分子在应对水体富营养化胁迫时存在明显异常表达。有研究表明：水体中有机磷含量过多的情况下，鱼类生物的胆碱酯酶容易发生磷酸化，形成稳定的磷酸化胆碱酯酶，从而导致胆碱代谢紊乱[51-52]。本文研究实验组成像结果所示，暴露在富营养化水质96 h后，斑马鱼体内的PCs在体内不同部位积累，一定程度上表明富营养化水质造成了斑马鱼体内一定的胆碱代谢紊乱，而这些磷脂酰胆碱分子组织特异性积累一定程度上说明，斑马鱼试图提高胆碱的PCs供应源用以弱化胆碱生成量的异常，从而试图维持斑马鱼正常生理活动。

水体中的污染物质积累容易导致水生生物体内脂质分子过氧化(lipid peroxidation,LPO)进而影响正常的生理活动和机体健康[53]，LPO是评估氧化应激的最常用方法之一[54]。水生生态系统中富营养化诱导的生物体氧化应激反应，可以显著影响水生生物的免疫能力，如降低机体抵御外援抗原的能力、增强对蠕虫等病原体的过度敏感性等，进而影响鱼类等生物的健康。在对墨西哥热带河流中水生生物的研究结果显示水体含磷化合物与水生生物脂过氧化应激水平相关[55]。本文研究发现脂质分子在富营养化水质胁迫斑马鱼体内不同程度的积累情况可能与斑马鱼应对体内脂质分子过氧化应激反应相关。尽管对于精确解读斑马鱼响应富营养化污染水质环境分子机理还需更多的研究进一步探索，但是本文研究初步证实了富营养化水质确实可以通过影响水生生物的生理生化过程(例如富营养化水质会造成斑马鱼体内脂质代谢过程的改变)，进而影响水生生物在水体中的正常生理活动行为。因此本文研究对于斑马鱼应对富营养化水质胁迫时体内脂质分子特异质性分布信息的揭示为进一步探究该模式物种体内脂质代谢分子机制奠定了初步实验基础。

3 结论

将新型质谱成像技术MALDI-MSI应用到水生脊椎模式动物斑马鱼中，以探索其响应富营养化污染水质内源性脂质分子变化规律。结果显示富营养化水质胁迫的斑马鱼体内PC(32∶0)、PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(36∶0)、PC(38∶6)、PC(40∶6)、PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)、PE(40∶9)共10种脂类分子表达发生了显著变化，MALDI-MSI原位表征直观地展示了这些脂类分子在斑马鱼体内的异质性分布情况，为斑马鱼响应富营养化污染水质分子机制的揭示提供了新的见解。尽管以上实验结果直接证明了斑马鱼应对富营养化水质胁迫时其体内脂质分子代谢确实出现了明显变化，但也需要更多的研究用以精确揭示该水生模式物种响应富营养化污染水质相关脂质代谢分子应对机制。

综上所述，本文研究为揭示斑马鱼响应富营养化污染水质脂质代谢分子变化规律奠定了实验基础，并进一步证实了MALDI-MSI技术作为一种新型分子影像方法在利用水生生物监测、评估水质环境研究中具有良好的潜在应用前景，可为未来水生生物生态生理学评估提供新的研究策略。