HPLC法测定干血滤纸片中苯妥英的浓度

王漪檬，马爱玲，赵宁民，马培志（郑州大学人民医院药学部，河南 郑州 450003）

苯妥英（phenytoin，DPH）为早期的经典抗癫痫药物，目前存在临床用量不断减少但又需长期进行血药浓度监测[1-4]（therapeutic drug monitoring，TDM）的矛盾现状。由于基层TDM开展不够广泛、在当地静脉采血后样品不易运输等原因，苯妥英的血药浓度监测呈现零星化态势，甚至有些医院已放弃此项检测。目前苯妥英的血药浓度检测方法有荧光偏振免疫法、酶放大免疫分析法、高效液相色谱法、液-质联用法、二维液相色谱法和毛细管电泳法等[5-10]。

干血滤纸片法（dried blood spots，DBS）作为一项成熟的方法，已广泛应用于新生儿筛查[11]，药物的检测[12-14]和基因测序[15]。其样品收集技术具有较大的优势[13]，包括样本的室温稳定性好、微创、成本低、易保存和运输、能够减少潜在的病原体感染风险等。其作为一种新颖的TDM方法，已有临床研究将该方法应用于丙戊酸、卡马西平（carbamazepine，CBZ）、他克莫司等药物浓度的检测[16-18]。本实验将HPLC法和DBS法相结合，旨为临床监测苯妥英的血药浓度提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Waters 1525高效液相色谱仪（美国沃特斯公司），Waters 2489紫外检测仪（美国沃特斯公司），AUW120D电子天平（日本岛津公司），SCILOGEX MX-S旋涡混合器（美国赛洛捷克公司），LG16-A高速离心机（北京雷勃尔公司），DS3120超声波清洗机（天津东康公司），Whatman 903滤纸（美国沃特曼公司，批号：6981314W131）。

1.2 试药

苯妥英对照品（中国食品药品检定研究院，含量98.6%，批号：100210-201002）；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，含量99.7%，批号：100142-201105）；空白EDTA全血由本院检验科提供；甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Venusil XBP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：235 nm；进样量：20 µL。

2.2 对照品溶液的制备

取适量苯妥英对照品，精密称定。置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为2000.0 mg·L-1的储备液，精密量取储备液适量，用甲醇定量稀释成浓度分别为3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1的系列对照品溶液。

2.3 内标溶液的制备

取卡马西平对照品适量，精密称定。置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.3 mg·L-1的内标溶液。

2.4 干血滤纸片的制备和处理

用移液器吸取50 µL已混匀的全血样本，滴于滤纸片的标示圆圈中心，使滤纸正面朝上，置于平坦洁净干燥的试管架上，室温条件下晾干（> 4 h）备用，晾干后置于塑料自封袋内保存，样本于冷藏2周或冷冻1个月内完成检测。

使用打孔器从制备好的滤纸片上打取直径为6 mm的血斑，置于1.5 mL离心管中，加入含有卡马西平内标的甲醇溶液200 µL，超声处理10 min，涡旋混匀5 min，15 000 r·min-1离心5 min。取上清液20 µL进样检测。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性考察 取空白全血样本、对照品样本、患者样本，分别按“2.4”项下操作后进样分析，记录色谱图（见图1）。结果显示苯妥英和卡马西平（内标）的保留时间分别为4.1 min和5.0 min。分离度良好，流动相、血液内源性杂质和内标均不干扰苯妥英的分析。

图1 HPLC色谱图A – 空白血样，B – 苯妥英+空白血样，C – 患者血样；1 – 苯妥英，2 – 卡马西平Fig 1 HPLC chromatogramA – blank blood sample, B – phenytoin + blank blood sample, C –blood sample of patients; 1 – phenytoin, 2 – carbamazepine

2.5.2 标准曲线和定量下限 配制苯妥英浓度分别为3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1的系列溶液，按“2.4”项下操作后进样分析。以峰面积（苯妥英峰面积/内标峰面积）为X，苯妥英浓度为Y进行线性回归，得到标准曲线：Y = 0.003 X + 0.001（r = 0.999，n =6）。结果表明苯妥英在3.1 ～ 100.0 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.5.3 回收率和精密度 取空白全血15份，制备浓度分别为8.1、16.3、32.5 mg·L-1的苯妥英低、中、高浓度样本各5份，按“2.4”项下操作后进样分析，计算其精密度、相对回收率、绝对回收率，结果见表1。

表1 HPLC法测定干血滤纸片中苯妥英浓度的回收率及精密度测定结果. n = 5Tab 1 Recovery and precision of phenytoin in dried blood filter paper by HPLC. n = 5

2.5.4 稳定性考察 按“2.4”项下要求，制备含有低、中、高三个浓度的苯妥英滤纸片，分别进行室温放置4 h、24 h、2 d、7 d、14 d；反复冻融1、2、3、4次及冰箱冻存1、7、14、28 d的稳定性试验。以室温放置4 h后的含量结果为100%，计算不同时间点浓度的偏差，均小于10%。结果表明含药滤纸片在上述条件下稳定性良好。

2.6 临床应用

收集20例需要检测苯妥英血药浓度的患者全血样本，先按“2.4”项下要求制备滤纸片，分析得到患者全血药物浓度A；将患者剩下的全血样本离心，所得到的血浆常规处理分析，得到患者血浆药物浓度B，使用SPSS 21.0软件对两组数据进行配对样本t检验，P> 0.05为差异无统计学意义；经Kolmogorov-Smirnova检验，两组数据均服从正态分布（P> 0.05），然后进行Pearson相关性分析，两组数据存在显著性正相关关系（sig. = 0.000，相关系数为0.994），即该方法可应用于临床，结果可信。但由于此次收集的样本量较少，更深入的研究将在今后的工作中持续进行。

3 讨论

3.1 苯妥英血药浓度监测现状

苯妥英主要用于预防和治疗癫痫[19]、三叉神经痛[20]和抗心律失常[21]等。因其上市较早，目前临床使用量有所下降，以我院为例，近三年对苯妥英的监测大幅减少（2020年79例次，相较于2018年减少50%）。我院作为三甲医院必须开展其血药浓度监测，所以将样本集中收集检测显得尤为重要。虽然临床对苯妥英的监测大幅减少，但经过数据检索，近些年对该药的研究仍较丰富，应用仍很广泛。有利用毛细管电泳法测定患者呼出气中的药物浓度[22]和使用LCMS/MS法测定患者头发中的药物浓度[8]的监测方法。从其它方面来看，有苯妥英和患者基因之间的关系[23-24]以及通过小鼠唇间质细胞中的微RNA-196a-5p抑制细胞增殖的相关研究[25]。故对于苯妥英的检测仍需持续进行。

3.2 方法学条件的选择

本实验选择HPLC法进行检测，主要考虑此方法在操作、成本和实用性上更适合临床的持续开展。流动相为甲醇-水，配置简单易储存，对色谱柱损害极小，无需柱前柱后冲洗转换。临床上苯妥英血药浓度的参考范围为10 ～ 20 µg·mL-1，本实验建立的标准曲线范围为3.1 ～ 100.0 mg·L-1，可满足临床需要。稳定性考察的结果为常温可保存14 d，保证了样本在收集运输和集中检测过程中保存完好。

3.3 滤纸的选择

本实验选用了临床常用，性质稳定可靠的Whatman 903滤纸，分别考察了其30 μL和50 μL的载样量。室温晾干时间分别考察了4、8、12、24 h 。超声处理时间分别考察了10、20、30 min。最后确定了50 μL的滤纸载样量、> 4 h的滤纸晾干时间和10 min的超声处理时间。

综上，此方法操作简单，样本收集便捷，若能将之应用于临床，能够更好的对患者进行血药浓度监测，保障其用药安全。