甜菜品种SSR指纹图谱的构建及遗传多样性分析

丁刘慧子 邳 植 吴则东

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，150080，黑龙江哈尔滨）

随着DNA分子标记技术快速发展，农作物品种鉴定进入了基因水平[6]。较为常见的分子标记技术有 RFLP[7]、RAPD[8]、AFLP[9]、EST[10]、ISSR[11]、SSR[12]、SRAP[13]及 SNP[14]等。SSR，即微卫星序列，是在真核生物中普遍存在的一段由1～6bp组成的重复序列，大约每10～50kb就存在1个微卫星[6]，且跨外显子和内含子，具有扩增多态性好、稳定可靠和重复性好等优点，已经被广泛应用于作物品种鉴定、遗传多样性分析和遗传图谱构建等领域。目前，玉米[15]、小麦[16]、马铃薯[17]和菜豆[18]等作物都已经利用SSR标记技术构建了指纹图谱。

近年来，甜菜分子标记发展较快[19]，已有研究[20]表明，优化甜菜SSR标记的鉴定体系，开发和筛选出甜菜专有的SSR引物成为甜菜品种鉴定的关键。本研究在前人研究的甜菜SSR分子标记基础上，开发了多对甜菜专用SSR引物，对2017年国家实行品种登记以来至2019年登记的107个甜菜品种进行指纹图谱构建和遗传多样性分析，对参试甜菜品种进行鉴定，为鉴定甜菜种子市场销售中品种的纯度和真伪性提供依据。同时对SSR引物进行多样性评价，筛选出具有高多态性的SSR引物，为甜菜品种鉴定等生物技术方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以目前我国市场上已经登记的107个甜菜品种为材料进行指纹图谱数据库的构建。品种详情见表1。

表1 供试甜菜品种及来源Table 1 Tested sugar beet varieties and sources

续表1 Table 1 (continued)

1.2 SSR引物

20对SSR标记引物序列来自黑龙江大学甜菜遗传改良育种重点实验室以及相关文献，或通过EST序列获得[21-23]（表2）。SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用HAP方式纯化。

表2 SSR引物信息Table 2 SSR primers information

1.3 基因组DNA的提取、纯化与检测

参试品种在黑龙江省哈尔滨市呼兰区试验地种植，试验地为地势平坦的黑土地，pH 6.5。该地属于中温带大陆性季风气候，全年活动积温≥2700℃，年均气温约6.1℃，年均日照约2555.7h，无霜期约150d。试验于2020年4月进行。机械开沟，人工播种，每个品种种植2行，行长10m，垄宽0.67m，株距20cm，播深约3cm。每个品种2次重复。在甜菜嫩叶时期，每个品种摘取10个单株幼叶进行混剪，采用 CTAB法[24]提取全基因组DNA。利用NanoDrop 2000/2000c超微量紫外可见分光光度计（Thermo公司）测定提取的DNA浓度和纯度，以OD260/OD280值为1.8～2.0作参照，不符合标准的样本重新提纯。将最终获得的符合试验要求的107个甜菜DNA样品稀释成10ng/μL的工作液，并置于-20℃冰箱备用。

1.4 PCR扩增

使用Veriti 96-Well Theraml Cycler PCR仪进行PCR扩增，反应体系5.0μL：DNA模板1.0μL，百泰克公司 2×TaqPCR Master Mix 2.0μL，水 1.0μL，上游和下游引物各0.5μL。

PCR反应程序：94℃预变性 4min；94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸7min。

1.5 电泳检测

采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳仪为Bio-Rad PowerPac 200。每孔点样 2μL，缓冲液 0.5×TBE，恒压 180V，电泳90min。电泳结束后，使用硝酸银法进行凝胶染色，将胶放入染色液中（180mL蒸馏水、20mL无水乙醇、0.4g硝酸银）5min，然后取出放入装有100mL蒸馏水的塑料盆中漂洗 60s，最后放入显影液（200mL蒸馏水、6g氢氧化钠和1mL甲醛）中，直至出现清晰条带，立即拍摄图像保存。

5.1 种公鸡要精选，保证精液质量，并定期检测公鸡精液质量，及时淘汰不合格种公鸡，保证种蛋受精率，降低饲养成本。

1.6 数据统计

每个样品的SSR扩增条带以0和1记录，在相同的迁移率位置上，有带记为 1，无带记为 0，构建0、1数字指纹图谱。SSR标记位点的多态性信息含量（polymorphism information content，PIC），按公式计算，其中Pi为i位点基因出现的频率。利用 PopGene软件对20对SSR引物的PCR产物进行多样性分析，计算各SSR引物的等位基因数（allele number，Na）、有效等位基因数（number of effective allele，Ne）、Shannon’s多样性指数（Shannon’s information index，I）和Nei’s指数（H）。利用 MEGA 7.0 软件计算品种间遗传距离，根据结果采用类平均法（UPGMA）进行聚类分析，绘制品种间亲缘关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 数字指纹图谱构建

将 PCR扩增产物进行电泳检测可以得到清晰的条带图。记录20对引物对107个甜菜品种扩增出的条带图，以此构建由20对引物对107个参试甜菜品种的0、1数字指纹图谱（全数字图谱略）。

以引物TC122扩增产物为例，约在500bp位置，1～48号甜菜品种扩增情况为 00001001100111 0100010110000100010100100000100000（图 1）。

图1 1～48号甜菜品种的TC122引物PCR扩增图谱Fig.1 PCR products fingerprintings of sugar beet varieties using primer TC122

2.2 SSR引物多态性

多样性分析结果（表3）显示，20对SSR标记共检测获得等位基因112个，变幅为2～9个，平均每对检测到5.6个，其中标记BVV45检测到的位点数最高为9，标记LNX21、LNX87、SSD81检测到的位点数最低为4。多态百分比在50.00%～100.00%，标记 LNX37最低，为 50.00%，标记 BVV21、FDSB1427、LNX87、LNX88、SSD81和 TC81最高，均为100.00%。20对SSR标记Na介于4～14之间；有效等位基因数Ne为 2.97～10.14；PIC值为0.08～0.83。其中BVV21、SB13和TC97的PIC值均≥0.75，具有高多态信息含量。H介于0.39～1.87之间，其中LNX63、TC97和TC122均＞1.50；I变异范围 0.78～2.90，LNX63、SB13、TC81、TC97、TC122均≥2.00，具有较高的群体遗传度。表明107个甜菜品种间变异范围较大，具有较为丰富的遗传多样性。

表3 供试材料SSR引物多态性信息Table 3 Polymorphism information of SSR primers in the tested materials

综合以上多态性指标来看，SSD130、SB13、TC81、TC97和TC122多态性较高，可作为甜菜品种鉴定的核心引物。其中TC81、TC97和TC122均为黑龙江大学甜菜遗传改良育种重点实验室开发的甜菜专用的SSR引物。

2.3 遗传距离及聚类分析

利用MEGA 7.0计算品种间遗传距离。图2显示，107个甜菜品种间最大遗传距离为0.467，最小为0.065，平均遗传距离为0.298。其中品种SD13829与HI1003、BTS8125与SR496、HX910和BTS8126、HX910与BTS8125、MA2070与KWS4502、MA097与金谷糖BETA218均为不同育种来源的甜菜品种，而品种 HX910和 SV2085均为荷兰 SES Vander Have品种，这 7对品种的遗传距离最远；品种KUHN1260与KUHN1357遗传距离最近，来源均为荷兰 SES Vander Have。聚类结果基本符合同一育种来源的甜菜品种遗传背景较相似的规律。

基于指纹图谱进行聚类分析（图2）。遗传距离在0.16时，可将107个甜菜品种分为2个类群。类群Ⅰ包括29个品种，类群Ⅱ包括78个品种。类群Ⅰ、Ⅱ又可分多个亚群。类群 I在遗传距离 0.14时，可分为2个亚群（Ⅰ-1、Ⅰ-2），亚群Ⅰ-1又可分为亚群Ⅰ-1-1和Ⅰ-1-2。亚群Ⅰ-1-1共 12个品种，其中22号KWS2314和25号BTS8840品种间遗传距离最近。亚群Ⅰ-1-2中，8号KWS3928和11号金谷糖BETA218遗传距离最近。类群Ⅱ在遗传距离0.14时可分为2个亚群（Ⅱ-1、Ⅱ-2）。亚群Ⅱ-1共13个品种，其中遗传距离最近的为73号MA3005和74号MA10-4。亚群Ⅱ-2共65个品种，其中102号KUHN1260与103号KUHN1357品种间遗传距离最近。

图2 107个甜菜品种的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 107 sugar beet varieties

在亚群Ⅰ-1-1的12个品种中23～27号均来自美国BETASEED公司；28～30号来自中国新疆农业科学院经济作物研究所；22、31、33和34号均来自德国KWS SAAT SE。在亚群Ⅰ-1-2中的品种也均来自这3个育种单位。说明这三者的甜菜品种的遗传背景具有相对较高的相似度。亚群Ⅰ-2-1中的12～15号甜菜均来自丹麦Maribohilleshög ApS。所以从类群Ⅰ的甜菜品种分类中，可以得出美国BETASEED公司、中国新疆农业科学院经济作物研究所、德国KWS SAAT SE、荷兰SES Vander Have和丹麦Maribohilleshög ApS 5个种子单位的甜菜品种具有较高的相似性，而且基本符合同一育种来源的品种具有较高遗传背景相似度的规律。

在亚群Ⅱ-1的13个品种中64～70和72号品种来自荷兰 SES Vander Have，73～76号来自丹麦Maribohilleshög ApS，仅有77号来自于中国黑龙江北方种业有限公司，这也进一步验证了之前得到的结论。

3 讨论

目前国内已有利用 ISSR[25]、SSR[26]以及SRAP[13]等分子标记构建国内外甜菜品种指纹图谱的报道，但所用的品种都较少，如刘蕊等[12]使用18个INDEL和SSR引物对21个甜菜品种进行遗传图谱的构建和聚类分析；王华忠等[27]利用SRAP和SSR分子标记技术对49个不同类型的甜菜进行了遗传多样性分析。SSR标记具有共显性、重复性好、高分辨率、多态性高和操作相对简单等优点[28]，在群体遗传结构和遗传多样性分析、物种进化、遗传图谱构建、基因定位及分子标记辅助育种等研究领域有广泛应用。这说明SSR标记在甜菜品种应用方面具有潜在价值，但是与其他作物相比仍然属于初级阶段。与大田作物相比，应用SSR标记分析甜菜遗传多样性的研究远远落后，国内外鲜有利用SSR标记进行甜菜遗传相关研究的报道。究其原因，SSR分子标记的开发具有一定的难度，成本较高；近年来，虽然甜菜种植面积有所上升，但仍属于小作物。因此甜菜的种子市场被国外品种占据，品种鉴定的研究就更少，这不利于对国内甜菜的品种保护和育种研究。由于我国非甜菜起源地，且甜菜起源单一，甜菜种质资源匮乏，同一优良不育系或者授粉系会在不同的品种中反复使用，造成甜菜品种遗传基础狭窄[29]。从本试验结果来看，各甜菜品种的遗传距离在0.065～0.467之间，这也在分子水平进一步证明了甜菜遗传基础狭窄。世界范围内的各大育种公司育成的甜菜品种也具有遗传距离较近的特点。结果得出，同一育种单位的品种具有更高的遗传相似性，美国BETASEED公司、中国新疆农业科学院经济作物研究所、德国KWS SAAT SE、荷兰SES Vander Have和丹麦Maribohilleshög ApS 5个种子单位的甜菜品种具有较高的相似性。

目前国内甜菜品种鉴定的进展较为缓慢，一方面是由于甜菜品种自身遗传性质的限制，另一方面，甜菜的经济现状（产量、生物量、抗逆性）由多个基因共同决定，并且受环境因素的影响，因此品种之间仅依靠形态学的差异进行鉴别十分困难，例如内蒙古自治区农牧业科学院甜菜研究所的甜菜品种内2499和内28102父本均为自交系RZ1，这就提高了形态鉴别的难度。其他作物，例如水稻（GB/T 1433-2007）和玉米（DB51/T 808-2008）等品种分子标记鉴定的国家标准和地方标准都是以SSR分子标记为基础[30]，因此利用分子标记手段进行品种真实性和纯度的鉴别将成为未来发展的必然趋势。

本试验扩大了供试品种的范围，涵盖了国内多数的甜菜品种，有利于规范甜菜种质资源，对市场的甜菜种子进行鉴定对开展甜菜基础研究意义重大。本试验也说明，SSR标记适用于甜菜品种纯度和真实性的鉴定。但目前用于甜菜鉴定的分子标记开发较少，可利用的核心引物有限，开发多态性高的SSR引物，并进一步鉴定优化影响甜菜品种纯度和真实性的条件，建立一套快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的技术体系，为品种纯度和真实性鉴定提供技术参考，建立完善的DUS测试技术体系，对今后甜菜品种的保护和市场良好发展意义重大。

4 结论

利用 20对 SSR标记引物对国内已经登记的107个甜菜品种进行了遗传多样性分析和品种鉴定。这20对SSR标记引物能够将107个甜菜品种完全区分开来，达到了品种鉴定的要求。同一育种来源的品种具有更高的相似性。通过SSR引物多样性分析得出SSD130、SB13、TC81、TC97和TC122多态性最高，可将这5对SSR引物作为甜菜品种鉴定的核心引物。