玉米HSP90基因家族的全基因组鉴定与分析

曹丽茹 王国瑞 张 新 魏良明 魏 昕 张前进 邓亚洲 王振华 鲁晓民

（河南省农业科学院粮食作物研究所，450002，河南郑州）

近年来，随着全球气温升高，干旱、高温、高盐等多种非生物胁迫频发，对农作物的正常生长产生较大影响。据统计，我国干旱及半干旱的地区土地面积占可耕地面积的一半以上，干旱对我国粮食的产量安全构成了巨大的威胁[1]。种植抗旱性强的品种是应对干旱胁迫较为经济有效的途径之一，从分子水平解析植物抗旱机制，培育作物抗旱新品种已然成为一种新的育种途径。

热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一种在自然界分布广泛、具有序列高度保守性等特点的应激蛋白，根据其蛋白分子量大小可分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和 sHsps五大类[2]。Hsp90家族蛋白是热激蛋白家族的重要成员，具有明显的3个区域：含有ATP结合和水解位点的N末端、中部区域（M）和包含二聚化作用区域的 C末端结构域[3-4]。Hsp90蛋白广泛参与植物的生长发育，在种子萌发、幼苗生长等生命进程中起着关键的作用[5-6]，其还具有伴侣活性，在蛋白的折叠、加工运输及降解等过程中扮演着重要角色[2]。研究[7-8]发现，当生物体受到外界刺激或非生物胁迫时，该类蛋白基因会大量表达，从而增强生物体对外界的适应能力。

热激蛋白在植物生长发育和响应非生物胁迫中扮演重要的角色。拟南芥、水稻和小麦等植物中的关于 HSP90响应逆境胁迫的报道较多，在模式植物拟南芥中，共有7个HSP90蛋白被发现，分别过表达AtHsp90.2、AtHsp90.5和AtHsp90.7基因的拟南芥植株在盐胁迫和干旱胁迫下，其发芽率和鲜重均明显低于野生型，表明过表达这些基因降低了植株的耐盐性和抗旱能力[9]。而水稻中发现有9个HSP90家族蛋白基因，OsHSP90-2和OsHSP90-4基因在热胁迫和干旱胁迫下的表达量增加；在酵母细菌中过表达OsHSP90-2基因，增强了其对热胁迫和干旱胁迫的耐受性；过表达OsHSP90-4的水稻植株耐热性增强[10]。小麦中的18个HSP90蛋白基因对热胁迫响应程度不同[11]。

玉米中关于HSP90家族基因的逆境响应研究报道较少。本研究根据HSP90基因家族成员的功能结构域，从玉米全基因组中筛选HSP90家族成员，对其进化树、保守基序（motif）、组织表达模式、响应干旱胁迫和复水过程进行分析，并预测蛋白互作关系，为进一步探究ZmHSP90家族成员的功能和作用机制提供参考，为培育抗旱新品种提供分子资源。

1 材料与方法

1.1 玉米HSP90基因的鉴定

从 Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index）数据库中下载玉米蛋白序列搭建Blast数据库，以HATPase_c和HSP90结构域（PF00183）为依据进行Blastp搜索（E≤10-5）。利用CDD（http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和 ProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）数据库对其蛋白结构域进行核对并去除冗余序列。从Ensembl Plants数据库中获得HSP90蛋白基因的染色体定位及位置、内含子数量、开放阅读框长度、编码氨基酸长度及编码蛋白分子质量和等电点及GO信息等。利用在线工具 Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测玉米HSP90蛋白的亚细胞定位[12]。

1.2 HSP90蛋白的进化树与序列分析

利用MEGA 6.0（最大临近法，Bootstrap设置1000次）对从Ensembl Plants数据库中下载的玉米、拟南芥和高粱的 HSP90蛋白序列进行系统进化树分析。利用TBtools软件对玉米HSP90蛋白进行基因结构分析[10]。利用在线工具MEME（http://memesuite.org/）对玉米HSP90蛋白进行motif分析。

1.3 玉米HSP90家族基因的组织表达模式分析

为了获取玉米 HSP90蛋白基因在各组织的表达情况，从Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）数据库中下载玉米 HSP90蛋白基因在根、茎、叶、花粉、雄穗、雌穗、胚乳和萌发2d的籽粒8个组织或器官的表达数据，利用TBtools软件进行整理。

1.4 ZmHSP90-1基因在干旱胁迫中的表达分析

试验材料选用前期筛选到的强抗旱（母本郑8713，M）和干旱敏感（父本郑K9713，F）2种不同基因型玉米自交系。选取颗粒饱满一致的郑8713和郑K9713种子播种在营养土中，生长至三叶一心时进行干旱胁迫处理，将长势一致的玉米苗转移至含有20% PEG6000的Hoagland’s营养液中，处理96h后进行复水处理，分别在处理0、12、24、36、48、60、72、84、96h和复水后1d和3d时取根、茎和叶于液氮中速冻，存放于-80℃冰箱，用于提取RNA。每个部位3个生物学重复。

提取处理样品的总 RNA，并反转录为 cDNA第1链作为模板。设计ZmHSP90-1特异性引物（F：5’-GTGACACGTCAGGGGAGC-3’，R：5’-CCAC AGGGAGATGGGGTA-3’），以玉米18rRNA（F：5’-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3’，R：5’-GTTAG CAGGCTGAGGTCTGG-3’）为内参基因进行定量分析，反应体系为Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10μL，cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，超纯水补足至20μL。反应程序为95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 30s，40 个循环。根据 2-△△Ct法计算基因的相对表达量。每个样品重复3次。

1.5 ZmHSP90-1的互作蛋白预测

利用在线工具STRING（https://string-db.org/）预测ZmHSP90-1的互作蛋白。

2 结果与分析

2.1 玉米HSP90基因的鉴定

从玉米数据库中得到了11个编码HSP90蛋白的基因，我们将其暂命名为ZmHSP90-1～ZmHSP90-11。由表1可知，ZmHSP90-1～ZmHSP90-11分布在第1、2、3、4、5、6、7、10号染色体上，其中第4、6和7号染色体上均含有2个编码玉米HSP90蛋白的基因，在第8、9号染色体上未见玉米HSP90蛋白基因。ZmHSP90-1～ZmHSP90-11内含子个数在2～20之间，开放阅读框长度在2028～2442bp之间，蛋白分子量在77.38～92.87kDa，等电点在4.62～5.03之间。亚细胞定位预测结果显示，编码ZmHSP90-3、-7、-9、-10蛋白的基因定位在内质网，编码ZmHSP90-2、-8蛋白的基因定位在内质网和线粒体，编码ZmHSP90-1、-4、-5、-6、-11蛋白的基因则定位在细胞质。玉米HSP90类家族蛋白在氨基酸长度、分子量、等电点和亚细胞定位等方面相似性较好，表明该类家族蛋白具有较好的序列保守性。

表1 玉米HSP90基因家族Table 1 HSP90 genes family in maize

2.2 玉米HSP90蛋白的进化树与序列分析

利用MEGA 6.0对玉米、拟南芥和高粱HSP90蛋白进化树进行分析，结果（图 1）显示，HSP90蛋白可划分为5个亚族，除了第5亚族不含有拟南芥 HSP90蛋白外，其余每个亚族中均同时含有拟南芥、高粱和玉米HSP90蛋白，表明玉米和高粱具有较高的亲缘关系。

图1 玉米、拟南芥和高粱HSP90蛋白的进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree of HSP70 proteins from maize, arabidopsis and sorghum

对玉米HSP90蛋白进行motif分析，结果（图2a）显示，在进化树中属于同一组蛋白的motif在个数、类型和顺序上类似甚至是一致的。基因结构分析结果（图2b）显示，ZmHSP90-7、-9具有20个内含子，ZmHSP90-3、-10含有 19个内含子，ZmHSP90-2、-8含有15个，ZmHSP90-6含有4个，ZmHSP90-11、ZmHSP90-4和ZmHSP90-1均含有3个，ZmHSP90-5含有2个。在进化树中属于同一组蛋白的基因的结构类似，推测同一组蛋白在功能方面具有类似的作用。

图2 玉米HSP90家族成员的motif和基因结构分析Fig.2 Analysis of HSP90 family motif and gene structure in maize

2.3 玉米HSP90家族基因的GO分析

在生物功能方面，ZmHSP90家族蛋白均参与了蛋白质的折叠过程（GO:0006457）。表 2结果显示，ZmHSP90-1、-4、-5、-6、-11参与了细胞对热的响应（GO:0034605），在稳定蛋白质方面也有功能（GO:0050821）。ZmHSP90-5蛋白还参与了伴侣蛋白介导的蛋白质折叠（GO:0061077）及对病菌的防御反应（GO:0009816）；在分子功能方面，ZmHSP90家族蛋白均可与ATP位点结合（GO:0005524），除了ZmHSP90-2蛋白外，其余ZmHSP90蛋白均可与某些未知蛋白结合（GO:0051082），其中ZmHSP90-5蛋白还可以与核酸结合（GO:0000166）；在细胞组分方面，ZmHSP90-1、-2、-4、-5、-6、-8、-11主要在细胞质周围分布（GO:0048471），ZmHSP90-3、-7、-9、-10主要在叶绿体基质中分布（GO:0009570）。

表2 玉米HSP90基因家族的GO分析Table 2 GO analysis of maize HSP90 family genes

2.4 玉米HSP90家族基因的表达分析

组织表达结果（图3）显示，ZmHSP90蛋白在玉米组织或器官均有表达，但各基因在不同的部位或者器官的表达量存在差异，基因间也存在较大的差异性。ZmHSP90-1～11在花粉和雌穗中的表达较低，在胚乳、雌穗、根、茎和叶中表达量相对较高。ZmHSP90-5、6、7在各个组织或器官中的表达量相对最小，其中ZmHSP90-5在茎、雌穗、花粉中几乎不表达，ZmHSP90-2、3、4、8、9、10、11主要在雄穗和胚乳中表达。ZmHSP90-1在各部位或器官的表达量相对较高，且在雄穗中表达量最高，在花粉表达量最低。ZmHSP90-1的高表达暗示着其在玉米正常发育过程中起着更为重要的作用。

图3 玉米HSP90家族基因在8个组织的表达谱Fig.3 Expression profile of HSP90 genes family of maize in eight tissues

2.5 干旱胁迫下ZmHSP90-1基因的表达分析

分析干旱胁迫下ZmHSP90-1基因在M和F这2个自交系中的表达模式，发现ZmHSP90-1基因积极响应干旱胁迫，在根、茎和叶中的表达趋势一致，均在胁迫48h时表达量达到最大。在叶、茎和根3个组织中，ZmHSP90-1在郑8713中的响应强度均大于郑K9713中，差异倍数为1.07（图4a）、1.09（图4b）、4.98（图4c）。推测ZmHSP90-1的表达量与玉米自交系的抗旱性强弱存在紧密的联系。

对郑8713中ZmHSP90-1在干旱胁迫中的表达模式进行进一步的分析，结果（图4d）显示，ZmHSP90-1在干旱处理12h开始表达量逐渐上升，在48h时表达量开始快速上升，并在60h达到了最大值，随后表达量降低。干旱处理96h后进行复水处理，在复水1d时表达量较低，随后升高，暗示ZmHSP90-1基因在玉米响应干旱胁迫和干旱―复水中扮演重要的角色。

图4 ZmHSP90-1在干旱胁迫下的表达分析Fig.4 Expression analysis of ZmHSP90-1 under drought stress

2.6 预测ZmHSP90-1的互作蛋白

为了探究ZmHSP90-1基因编码蛋白的互作关系，对ZmHSP90-1的互作蛋白进行预测。结果（表3）显示，ZmHSP90-1可能与SGT1类蛋白、伴侣蛋白SBA1、HSP蛋白ATPase的激活剂、蛋白质精氨酸 N-甲基转移酶1.5、整合素β-1-结合蛋白2以及锚蛋白等存在互作关系，推测ZmHSP90-1可能与这些互作蛋白协同参与植物的抗病和抗逆等过程。

表3 ZmHSP90-1功能互作蛋白预测Table 3 Functional interaction protein prediction of ZmHSP90-1 gene

3 讨论

本研究从玉米全基因组中鉴定出11个ZmHSP90家族成员。对玉米、拟南芥和高粱的HSP90蛋白进行系统进化树分析，发现 HSP90蛋白分为 5个亚族，且在每个亚族中均有ZmHSP90蛋白的存在。同一亚族的ZmHSP90在基因结构、motif分布和数量、亚细胞定位方面均有相同或者类似的特征，推测同一亚族ZmHSP90可能存在相似的生物学功能。有研究[13-15]表明，AtHSP90-5（AT2G04030）参与了拟南芥的生长发育和叶绿体的形成，对其进行插入突变，导致了其萌芽期死亡。AtHSP90-1（AT5G52640）和AtHSP90-2增强了酵母细胞在盐和热胁迫下的存活率[16]。AtHSP90-7（AT4G24190）通过调控AtNMig1基因，参与拟南芥响应高温、干旱和高盐胁迫的过程，暗示其在植物响应非生物胁迫中具有重要的作用[17]。本研究对ZmHSP90家族蛋白进行GO富集分析，证实了ZmHSP90家族成员参与相关蛋白质的后期加工，且对热胁迫响应和稳定蛋白质结构方面也起着关键作用，研究结果与前人结论[18-20]较为一致。表明ZmHSP90家族基因在植物防御非生物胁迫方面具有积极的作用，有进一步探究其功能和作用机制的价值。

本研究发现ZmHSP90家族成员在玉米的不同组织或器官中均有表达，其中ZmHSP90-1基因在各组织中的表达量均相对较高，暗示其在玉米的生长发育中或许起着较为重要的作用。ZmHSP90-1与ZmHSP90-6属于同一亚家族，有报道[21]证实ZmHSP90-6基因的过表达增强了转基因拟南芥对干旱和高温的耐受性，推测ZmHSP90-1也可能存在类似功能。本研究发现该基因响应干旱胁迫，在干旱胁迫24h时ZmHSP90-1基因的表达量显著升高，60h时达到峰值，是对照（0h）的近50倍；复水后，其表达量先显著下降，然后随着复水时间的延长，表达量显著升高，表明ZmHSP90-1基因正向积极响应干旱胁迫和复水过程。为进一步探究ZmHSP90-1基因的调控网络，本研究对ZmHSP90-1编码的蛋白进行互作蛋白预测，发现这些互作蛋白参与植物的抗病、调控植物的非生物胁迫应答等过程。研究[22-23]显示SGT1参与植物抗病、响应非生物胁迫等过程；肽基脯氨酰顺反异构酶与蛋白质的正确折叠有关，王萍[24]研究发现棉花肽基脯氨酰顺反异构酶基因AY972810在盐胁迫下表达量升高；棉花的伴侣蛋白SBA1与HSP90蛋白存在相互作用关系，但SBA1与HSP90结合会导致ATPase酶活性降低[25]。拟南芥中，蛋白质精氨酸甲基转移酶SKB1是植物感知胁迫并调控发育过程的重要因子，SKB1的功能缺失会导致拟南芥对盐胁迫超敏感、生长迟缓及晚花等缺陷[26]。整合素β-1-结合蛋白2在动物中的研究较多，主要介导细胞―基质间的信号转导[27]。锚蛋白主要介导蛋白质―蛋白质的相互作用，广泛参与细胞生命活动的调节[28]。推测ZmHSP90-1可能与这些潜在的互作蛋白有协同作用，调控植物的生长发育和响应非生物胁迫过程。本研究从玉米全基因组水平鉴定出11个ZmHSP90家族成员，对其功能结构域、基因结构、motif、GO富集和组织表达特性进行了系统分析。证实了ZmHSP90-1基因积极响应干旱胁迫和复水过程，同时预测了潜在互作蛋白及可能存在的调控网络，为进一步探究ZmHSP90-1抗旱功能和作用机制奠定基础，同时为研究其他ZmHSP90家族成员响应逆境胁迫的功能提供参考。

4 结论

筛选出的 11个玉米ZmHSP90家族基因被划分为5组，相邻进化树分支的同一亚家族蛋白具有相似的结构域，推测存在类似的生物学功能。发现11个ZmHSP90基因在不同组织或器官中均有表达，其中ZmHSP90-1在多个组织和器官中均高表达，且ZmHSP90-1基因在耐旱性强的玉米自交系郑8713中表达量高于干旱敏感性自交系郑K9713，说明该基因正向积极响应旱胁迫和复水过程。蛋白互作预测说明ZmHSP90-1可能与其互作蛋白协同参与玉米的生长发育及响应非生物胁迫过程。