三七皂苷R1对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的作用机制

方芳 范虹 樊光辉*

动脉粥样硬化（AS）是诱发心脑血管病的主要病理基础，目前与其相关的心脑血管疾病发病率呈年轻化，且有持续上升的趋势［1］。虽然经皮冠脉支架植入术、冠脉搭桥术能对病变血管行再次血运重建，但最终还是不能干预AS 病理进程。随着调脂、抗血小板聚集等药物的临床应用，动脉粥样硬化的病死率虽有所下降，但存在一定的不良反应，预后不理想。因此采取安全、积极、有效措施干预AS，对防治心血管事件具有十分重要的现实意义。三七是祖国医学经典的活血化瘀代表药物之一，具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等诸多药理作用［2］。三七皂苷R1（NR1）是三七的主要活性单体之一，不仅具有调节血压、保护心肌、改善缺血缺氧性脑病的多重功效，还有毒副作用小、多靶点、整体调节的独特优势［3］。本研究以Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠，建立动脉粥样硬化模型，观察NR1 对AS 斑块的作用，以期为中医药有效防治血管类疾病提供重要的实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 三七皂苷R1（110745，中国药品生物制品检定所）；血管紧张素Ⅱ（Sigma，USA）；微泵（Alzet Model 2004，USA）。

1.2 实验动物及饲料 8～10 月龄雄性ApoE-/-小鼠（40只）购自武汉大学动物实验中心，体质量约22～33 克；饲养于武汉大学动物实验中心SPF 级动物房，予以正常实验饮食（D12450B，北京华阜康生物科技有限公司）。

1.3 主要试剂及仪器 油红O 溶液（O1391～250ML，Sigma）；伊红染液（水溶性）（BA-4024，BASO）；苏木素染液（G1004，武汉赛维尔生物科技有限公司）；Elisa 试剂盒（PMTA00B for TNF-α，PMLB00C for IL-1，PM6000B for IL-6，PMJE00 for MCP1）（R&D Systems）；SMA抗体：Rabbit polyclonal to mouse alpha smooth muscle Actin（ab5694 1：100，Abcam）；超速离心机（XL-90，美国Beckman 公司）；体视显微镜（SZ61，OLYMPUS）。

1.4 分组及模型制备 40 只ApoE-/-小鼠予普通饲料喂养1周，随机分为给药组和对照组，每组各20只。两组均皮下植入含有血管紧张素Ang Ⅱ［1000 ng/（kg·min）］微泵，持续诱导4 周，建立AS 模型［4］。造模第2 天，给药组将三七皂苷R1 粉末溶于无菌生理盐水中，配制浓度为2.5 mg/mL，腹腔注射NR1 25 mg/（kg·d）；对照组：每日腹腔注射与NR1 等体积的生理盐水。

1.5 实验方法（1）小鼠体质量监测及生化检查：术前1 周、术后1、2、4 周，通过测量小鼠体质量，调整NR1 腹腔注射量。于末次给药24 h 后，乙醚麻醉小鼠后从眼眶采血，4000 r/min，离心30 min，取血清并稀释2.5 倍后检测血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C，检测由MODULAR 全自动生化鉴定仪完成。（2）血清炎症因子检测：按上述方法提取小鼠血清并稀释2.5 倍后，参照 ELISA 试剂盒说明书，分步检测血清炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β 和MCP-1）水平。（3）组织病理学检测：3%戊巴比妥钠（90 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离小鼠主动脉，尽量保留主动脉弓分支，剥除外膜脂肪。石蜡标本：4%多聚甲醛中固定>24 h，石蜡包埋，主动脉根部和头臂干切片行HE 染色，光镜下观察拍片，Image-Pro Plus 5.0 图像分析测定单位坏死中心面积。冰冻标本：4%多聚甲醛中固定24 h，20%蔗糖溶液中脱水过夜，冰冻切片包埋剂进行包埋，将主动脉树进行油红O 染色，完成拍照，使用Image Pro Plus 6.0 软件统计损伤面积。主动脉根部行免疫荧光检测。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件。符合正态分布计量资料以（）表示，两组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NR1 对小鼠体质量的影响 见表1。

表1 两组小鼠各阶段体质量比较［g，（）］

表1 两组小鼠各阶段体质量比较［g，（）］

2.2 NR1 对小鼠血脂的影响 见表2。

表2 两组实验小鼠治疗前后血脂比较［mg/dL，（）］

表2 两组实验小鼠治疗前后血脂比较［mg/dL，（）］

注：与同组治疗前比较，#P<0.05，##P<0.01；与对照组治疗后比较，**P<0.01

2.3 NR1 对小鼠主动脉斑块的影响 Ang Ⅱ皮下微泵诱导小鼠4 周，取主动脉行HE 染色、油红O 染色，两组小鼠可见大量粥样硬化斑块形成，表明AS 建模成功。斑块主要集中于主动脉根部及头臂干。HE 染色，光镜下选取6 个视野拍片发现，给药组比对照组可缩小主动脉根部（见图1）、头臂干（见图2）单位坏死中心面积（P<0.01）。通过主动脉油红O 染色，计算阳性染色区域所占主动脉的百分比。对照组脂滴颗粒状堆积并融合成片；给药组脂滴数量降低，体积明显减小，呈小颗粒、片状、稀疏分布。给药组在减少斑块面积，降低脂质积聚方面优于对照组（P<0.05）。见图3。

图1 两组小鼠主动脉根部单位坏死中心面积比较（HE染色，×100）

图2 两组小鼠头臂干单位坏死中心面积比较（HE染色，×100）

图3 两组小鼠主动脉斑块形成比较（油红O染色）

2.4 NR1 对斑块内平滑肌细胞的影响 免疫荧光检测发现，与对照组比较，给药组能明显增加AS 斑块中VSMC 的含量（α-SMA 阳性细胞为绿色）。见图4。

图4 两组小鼠主动脉根部斑块内α-SMA含量比较

2.5 NR1 对循环中炎性因子水平的影响 与对照组比较，给药组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1 和MCP-1 的含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）。见图5。

图5 两组小鼠治疗后血清TNF-α、IL-6、IL-1和MCP-1浓度比较

3 讨论

血脂异常是目前公认与AS高度关联的重要危险因素之一［5］。研究发现，高LDL-C 不仅影响斑块体积，且可通过氧化反应转变成ox-LDL，被巨噬细胞摄取后引起胆固醇积聚、斑块内脂质含量增加，介导不稳定性斑块进展［6］。VSMCs 在AS 发展中具有重要作用，其迁移密度与进展期斑块脂核上纤维帽的厚度明显相关［7］。提示斑块稳定性与血脂水平、VSMCs 含量紧密相关。本研究结果显示，NR1 能减轻AS 斑块的形成，同时还可减少斑块内脂质的积聚，降低血清TG、LDL-C 水平。免疫荧光检测平滑肌肌动蛋白（α-SMA）含量显示，α-SMA 在治疗组中阳性表达量高于对照组，提示NR1能够通过降脂，干预AS 危险因素抗动脉粥样硬化，并可能通过增加AS 斑块中VSMCs 数量来增加斑块的稳定性。

动脉粥样硬化是渐进发展的动脉血管炎性疾病［8］。持续皮下作用Ang Ⅱ不但可促进外膜成纤维细胞炎性因子的表达，且还是巨噬细胞趋化、黏附、极化的重要调控因素；Ang Ⅱ通过促炎，加速小鼠动脉粥样硬化斑块的形成［9］。TNF-α 表达增加可促进斑块中炎症反应，加速粥样斑块进展［10］。IL-6 浓度升高与AS 斑块不稳定性相关，主要通过促进血小板活化，加速凝血进程，其与TNF-、Ang Ⅱ相互影响，是诱发心血管疾病的三项主要危险因素［11］。IL-1 在内皮细胞内表达，可引起VCAM-1 水平升高、单核细胞黏附聚集而影响动脉粥样硬化进程［12］。MCP-1 聚集、诱导单核巨噬细胞吞噬ox-LDL，因泡沫细胞的形成而促进脂质不断积聚［13］。故炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 和MCP-1 是影响动脉粥样硬化的敏感指标。本研究结果显示，三七皂苷R1能降低AS 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1、MCP-1 水平，提示三七皂苷R1 抗动脉粥样硬化作用与抑制外周循环炎性因子的表达相关。

综上所述，三七皂苷R1 具有抗Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠AS 的作用，其机制可能与调节脂质代谢、抑制炎症因子的激活和改变斑块内组分等相关。基于NR1 可减少AS 斑块的脂质负荷并增加斑块内平滑肌细胞的含量，今后可进一步探讨NR1 对斑块稳定性的影响，寻求促使VSMCs 转化为有利表型的安全、有效治疗策略，对于防治AS 具有重要临床意义。