木犀草素对慢性肾衰竭大鼠c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路及肾小球基膜增生的影响

周燕 郭珊岚 兰秀君 杨君华

慢性肾衰竭(CRF)是各种慢性肾脏疾病导致肾功能障碍直至衰竭的现象,病理变化多出现肾小球功能变化和肾间质改变[1]。其中肾小球基膜(GBM)增生会降低肾小球滤过率，加重疾病,因此减缓GBM增生对缓解CRF具有保护作用。木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学活性；筋骨草主要成分为木犀草素,在系膜增生性肾小球肾炎中具有缓解疾病效果[2],但对GBM增生的作用尚不明确。c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)均属应激活化蛋白激酶,可被炎症、纤维化等激活,激活MAPK信号通路可刺激肾脏细胞增殖分化、促进纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)等合成[3-4],加重肾脏相关疾病发生发展。推测木犀草素可能通过JNK/MAPK信号通路从而影响CRF大鼠GBM增生。基于此,本研究采用腺嘌呤溶液连续灌胃21天建立CRF大鼠模型,探究木犀草素对CRF大鼠的影响,并初步探讨其机制。

材料与方法

1.材料:实验动物:健康SD大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司,SDF级,许可证号:SCXK(京)2018-0021,体质量(200±20)g]于我院动物实验中心以温度(25±1)℃、湿度(50±5)%、12 h光照/12 h黑暗饲养。试剂:腺嘌呤(国药集团化学试剂有限公司)；木犀草素(德国Sigma公司)；盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司)；苏木素-伊红(HE)、改良三色染色(Masson染色)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；兔抗一抗JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、p38 MAPK、丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、二抗羊抗兔、FN酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国abcam公司)；ColⅣ ELISA试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)。仪器:全自动生化分析仪(北京泰林东方商贸有限公司)。本实验经我院伦理委员会审批通过。

2.方法

(1)实验动物模型建立:将50只SD大鼠随机分为模型组、木犀草素低、中、高剂量组、阳性对照组,每组各10只,根据参考文献[5]中的方法建立大鼠CRF模型，以25%腺嘌呤溶液(250 mg/kg)连续灌胃21天，造模结束后第7天时,木犀草素低、中、高剂量组大鼠分别以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg木犀草素灌胃,阳性对照组大鼠以2 mg/kg贝那普利灌胃[6]；另取10只大鼠作为正常组，正常组和模型组大鼠以等体积生理盐水每天1次灌胃,均连续灌胃28 d，正常组大鼠在此期间正常饮食饮水。实验结束后收集代谢笼中24 h尿液；腹主动脉取血；收集左侧肾脏,部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80 ℃冰箱中待检。

(2)大鼠一般情况收集:观察各组大鼠实验结束后的精神状态,于实验前、后分别记录体质量,并收集24 h尿液，采用全自动生化分析仪检测大鼠24 h尿蛋白水平。

(3)HE、Masson染色观察肾脏组织形态:大鼠肾脏于4%多聚甲醛中过夜后取出,制备常规石蜡切片后进行HE、Masson染色。采用光学显微镜拍照观察肾脏组织结构。

(4)肾功能生化指标检测：采用自动生化分析仪检测血液中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平。

(5)蛋白质免疫印迹检法测肾脏组织JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK水平:于-80 ℃冰箱中取部分肾脏组织，在冰上研磨并裂解30 min，提取总蛋白,凝胶电泳分离蛋白质后PVDF转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入一抗JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、GADPH,4 ℃孵育过夜；加入对应二抗,室温孵育2 h。采用蛋白凝胶成像仪拍照和灰度分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度/相对内参灰度。

(6)ELISA检测肾脏组织中FN及ColⅣ水平:于-80 ℃冰箱取部分肾脏组织在冰上研磨并裂解30 min,采用ELISA试剂盒检测肾脏组织中FN、ColⅣ水平。

结 果

1.6组大鼠实验前后体质量、24 h尿量及24 h尿蛋白水平比较：实验后,模型组大鼠精神状态较差,体质量低于同期正常组，24 h尿量、24 h尿蛋白水平均高于同期正常组(P<0.05)；木犀草素中、高剂量组、阳性对照组大鼠精神状态较同期模型组均有一定程度改善,体质量较同期模型组均升高,24 h尿量、24 h尿蛋白较同期模型组均降低(P<0.05)。见表1。

表1 6组大鼠实验前后体质量、24 h尿量及24 h尿蛋白水平比较

2.6组大鼠肾脏组织HE、Masson染色结果:光镜下可见正常组肾脏组织结构清晰,肾小球结构正常；模型组GBM增生,肾小管萎缩,局部灶紊乱明显,肾小球和肾小管纤维胶原沉积现象明显；与模型组比较,木犀草素低、中、高剂量组随剂量增加GBM增生现象缓解,肾小球和肾小管纤维化程度降低，阳性对照组肾脏组织GBM增生不明显,但肾小球和肾小管纤维化明显。见图1。

图1 6组大鼠肾脏组织病理染色结果(A、G：正常组；B、H：模型组；C、I：木犀草素低剂量组；D、J：木犀草素中剂量组；E、K：木犀草素高剂量组；F、L：阳性对照组；A、B、C、D、E、F：HE染色；G、H、I、J、K、L：Masson染色；×200)

3.6组大鼠SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平比较:与正常组比较,模型组SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平均升

高(P<0.05)；与模型组比较,木犀草素低剂量组BUN、UA、ColⅣ水平均降低，木犀草素中、高剂量组、阳性对照组SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平均降低(P<0.05)。见表2。

4.6组大鼠肾脏组织中JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38MAPK水平比较：与正常组比较,模型组肾脏组织p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平均升高(P<0.05)；与模型组比较,木犀草素中、高剂量组、阳性对照组肾脏组织中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平均降低，木犀草素低剂量组肾脏组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK水平降低(P<0.05)。见图2、表3。

组别SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)UA(μmol/L)FN(ng/ml)ColⅣ(ng/ml)正常组50.46±12.456.08±1.5353.44±8.6619.46±3.1524.75±3.53模型组186.48±20.18a16.43±2.14a130.46±11.33a63.55±12.15a53.22±7.26a木犀草素低剂量组173.66±14.8613.46±1.44b100.58±8.16b56.45±10.1641.17±6.33b木犀草素中剂量组143.18±12.19b10.35±2.19b76.59±8.39b41.14±6.45b32.84±5.49b木犀草素高剂量组89.96±9.18b8.66±1.34b61.69±7.34b25.56±4.18b27.46±4.12b阳性对照组106.47±10.32b8.98±1.86b64.58±6.98b21.16±4.53b31.45±3.86bF值145.45843.493115.16462.93439.396P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

图2 6组大鼠肾脏组织中JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK水平(A：正常组；B：模型组；C：木犀草素低剂量组；D：木犀草素中剂量组；E：木犀草素高剂量组；F：阳性对照组)

组别JNK/GADPHp-JNK/JNKp38 MAPK/GADPHp-p38 MAPK/p38 MAPK正常组0.89±0.180.16±0.050.31±0.060.36±0.05模型组0.92±0.210.98±0.18a0.32±0.051.23±0.21a木犀草素低剂量组0.90±0.180.86±0.150.29±0.041.03±0.17b木犀草素中剂量组0.87±0.140.54±0.12b0.34±0.030.86±0.09b木犀草素高剂量组0.93±0.150.32±0.07b0.32±0.040.05±0.01b阳性对照组0.91±0.130.35±0.04b0.33±0.030.07±0.01bF值0.166780.4211.604184.783P值0.974<0.0010.173<0.001

讨 论

CRF会出现免疫力低下、神经功能障碍等多种并发症,影响机体正常活动,对机体危害严重[7]。木犀草素属黄酮类化合物,具有抗凝血、扩张血管、抗炎、促进免疫调节等作用[8]。本研究发现,CRF大鼠肾脏组织中肾小球和肾小管出现功能障碍,使肾脏组织滤过性降低,尿蛋白量增加,机体蛋白流失,从而降低大鼠体质量,使其精神变差,而木犀草素可能通过减弱GBM增生、使肾小球扩张从而缓解大鼠尿蛋白水平增加、体质量降低现象，并改善精神状态。

SCr、BUN、UA均可反映肾功能损伤情况。其中SCr属肌肉代谢产物，BUN属血浆中含氮化合物，UA为嘌呤代谢产物,正常情况下均由肾小球滤过排泄体外，而肾功能障碍时在体内积累,对机体造成伤害[9-10]。本研究发现,CRF大鼠肾小球功能出现障碍,滤过率降低,导致SCr、BUN、UA在体内累积,损害机体健康。木犀草素处理CRF大鼠后可缓解其肾功能,使肾小球滤过率升高,降低SCr、BUN、UA水平,实现对机体的保护。

JNK作为MAPK家族的主要成员之一,活化后可与多种基因结合发挥作用[11]；在肾小球损伤反应性GBM增生中处于活化状态,抑制JNK活化，可有效抑制细胞增殖[12]。p38 MAPK作为MAPK家族的另一重要成员,在局部灶肾小球硬化中可通过结缔组织生长因子促进细胞外基质沉积和FN产生,加速疾病进程[13]。JNK可识别MAPK序列,组成蛋白复合物发生作用,活化的JNK与p38 MAPK通过促进作用,共同调控刺激分子发挥作用[14]。如共同促进作用调控激活蛋白-1活化,其中FN上存在激活蛋白-1位点,调控激活蛋白-1活化可间接促进FN活化；FN作为GBM的主要成分,过表达可导致GBM细胞增生,加重肾小球病变[15-16]。FN、ColⅣ均作为GBM和毛细血管基膜重要成分,与GBM细胞增生关系密切,过度升高可导致GBM异常增生[17]。本研究发现,CRF中JNK、p38 MAPK均处于活化状态,激活JNK、p38 MAPK可促进细胞外基质沉淀和促进FN、ColⅣ水平升高,而FN、ColⅣ作为GBM的主要成分,其水平升高可促进GBM增生,加快疾病进程。木犀草素可通过抑制上述过程实现对GBM增生的缓解从而实现对CRF大鼠的保护。

综上所述,本文发现木犀草素对CRF大鼠具有保护作用,木犀草素可缓解CRF导致的GBM增生,可能是通过抑制JNK/MAPK信号通路实现的。