类风湿关节炎相关肺间质病变生物标志物

徐洪琳，张蜀澜

肺间质病变(interstitial lung disease, ILD)是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)最常见的关节外表现，以普通型间质性肺炎(usually interstitial pneumonia, UIP)最为常见。约60%～80%的RA患者出现肺部受累，但仅约10%患者出现ILD临床症状。由于缺乏统一的诊断标准和检测方法，尚未有确切的人群发病率。并发ILD是RA患者死亡的主要原因。RA-ILD死亡风险比率较单纯RA高2～10倍，死亡率大约为13.9%[1]。因此，早期发现和及时治疗对降低RA-ILD的发病率和死亡率有重要作用。目前，RA-ILD诊断主要依靠生物标志物、临床表现和影像学检查结果进行综合判断。血清高水平类风湿因子(rheumatoid factor，RF)和抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP)是RA-ILD的危险因素[2-3]，研究发现以ILD为首发表现的RA-ILD患者血清中含高滴度的ACPA和RF[4]，因而进一步研究抗瓜氨酸蛋白抗体谱 (anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)有助于深入了解RA-ILD发病机制。此外，涎液化糖链抗原-6(Krebs von den Lungen-6，KL-6)在结缔组织病相关肺间质病变的诊断、预后评估和风险分层中发挥重要作用[5-7]，但是缺乏足够的临床研究将KL-6纳入RA-ILD临床常规检测。因此，需要寻找新型生物标志物用于RA-ILD风险预测和预后评估。

本文将对历年来文献报道的RA-ILD相关基因，自身抗体和靶抗原进行综述，寻找有较好诊断价值的生物标志物，探究与肺损伤相关联的自身抗体在RA-ILD的发病机制中的可能作用，并发现可用于预后评估和鉴别诊断的潜在生物标志物，为临床诊断RA-ILD提供新思路。

1 RA-ILD相关基因

RA-ILD发生发展受基因和环境因素共同影响。研究发现人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)与RA-ILD易感性相关。HLA-DRβ链的第70-74位基因序列高度保守，RA相关的HLA-DR等位基因共同享有该保守序列，故称其为共同表位(shared epitope, SE)。Furukawa对日本人群研究发现不同HLA等位基因对于RA并发ILD的风险有不同影响，HLA-DRB1*04，HLA-DQB1*04和SE对RA-ILD有保护效应，而HLA-DRB1*16是RA-ILD的危险因素[8]。此外，在一项纳入116名韩国RA患者的研究中，Song等[9]发现HLA-RDB1核苷酸序列的第九位色氨酸和RA-ILD易感性相关，OR值为22.89，P=0.037。

MUC5B是由呼吸道分泌的胶原形成蛋白，肺纤维化患者MUC5B分泌增多。MUC5B启动子变异rs35705950在特发肺纤维化中的阳性率为38%，家族性间质性肺炎为34%，健康个体为9%[10]。近年来，有研究发现MUC5B是RA-ILD的危险因素。Juge等[11]对中、美、德、日等多个国家人群分析，结果表明MUC5B基因变异和UIP相关，OR值为6.1；620名RA-ILD患者中MUC5B基因出现频率为32.6%；免疫组织化学染色显示细支气管上皮细胞胞质和蜂窝状囊肿的黏液内含有MUC5B基因编码产物。 Hunninghake等[12]研究发现MUC5B基因变异和一般人群的肺间质异常有关，提示MUC5B启动子基因多样性可能用于预测肺间质病变的发病风险。

考虑到RA-ILD和家族性肺纤维化均存在UIP临床特征以及共同的环境危险因素，Juge等[13]对101例RA-ILD患者进行全外显子组测序，并比较81例RA-ILD患者和1 010名健康人群的突变基因的数量差异，结果显示RA-ILD和家族性肺纤维化相关基因(TERT、RTEL1、PARN、SFTPC) 存在关联，OR值为 3.17，P=9.45×10-4。近期，Shirai等[14]对日本受试人群进行全基因组关联性研究，新发现RA-ILD相关基因变异—RPA3-UMAD1。RPA3是复制蛋白A复合物的组成部分，在DNA复制和损伤应答中发挥重要作用，该基因变异可提高RPA3在肺组织中的表达水平，增加RA-ILD患病风险。

总之，寻找与RA-ILD相关的基因变异，探究基因变异与临床表型的关系，分析基因功能有助于阐明RA-ILD复杂的发病机制，也有利于疾病预测和风险评估。

2 RA-ILD风险预测相关标志物

2.1 α-烯醇化酶

α-烯醇化酶是一种糖酵解酶，在细胞分化和炎症刺激时上调表达。瓜氨酸CEP-1是RA特异性的自身抗原，而CCP-2是人工合成多肽，所以抗CEP-1抗体能更好地反映RA的发病机制。Mahdi 等[15]研究发现抗CEP-1抗体，吸烟以及RA相关基因HLA-DRB1*04之间存在强关联。Alunno等[16]研究结果提示抗CEP-1抗体与RA-ILD相关，OR值为2。Liu等[17]比较抗CEP-1抗体与抗CCP-2抗体的诊断价值，研究发现抗CCP-2诊断RA阳性似然比为10.11，高于抗CEP-1抗体(5.82)。当抗CEP-1抗体水平大于185.91 U/mL时，抗CEP-1抗体可用于预测RA-ILD，OR为0.383，P=0.0222，而抗CCP-2抗体则与RA-ILD无相关性，说明抗CEP-1可能无法替代抗CCP-2抗体作为RA实验室检查的常规项目，但是可作为补充实验用于疾病分型诊断。

2.2 抗氨基甲酰化蛋白抗体

氨基甲酰化蛋白(carbamylated protein，CarP)是另一种翻译后修饰产物，在氰酸盐和尿素参与下，赖氨酸转变为高瓜氨酸。尽管高瓜氨酸和瓜氨酸结构相似，但是ACPA和抗CarP抗体之间无交叉反应，故这两种自身抗体属于不同的抗体家族[18]。Shi等[19]发现抗CarP抗体存在于RA患者血清中，且该自身抗体和关节损伤严重程度相关。抗Carp抗体在抗CCP-2抗体阳性的RA患者中阳性率为49%～73%，8%～14%抗CCP-2抗体阴性的RA患者血清中也存在抗Carp抗体[20]。此外，吸烟者和哮喘患者的肺组织中存在氨基甲酰化抗原，抗Carp抗体识别并结合该抗原，可能会诱发炎症级联反应，对于肺间质病变的发生发展有重要意义。Castellanos-Moreira等[21]首次报道抗CarP抗体和RA-ILD存在关联。一项纳入142例RA患者和37例RA-ILD患者的研究显示，RA-ILD组抗CarP抗体阳性率和滴度较单纯RA组高(P<0.05)，其中抗嵌合纤维蛋白/丝氨酸高瓜氨酸化蛋白抗体滴度是单纯RA组的四倍(P<0.005)。可见，抗Carp抗体与RA-ILD可能存在关联，还需要更多的研究验证。

2.3 肺泡表面活性蛋白

肺泡表面活性蛋白(surfactant protein D and surfactant protein A，SPD，SPA)是脂蛋白复合物，主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞和Clara 细胞分泌，具有降低肺泡表面张力、防止呼气时肺泡上皮细胞塌陷的作用。SPA和SPD属于胶原凝集素家族，参与肺组织免疫防御。血浆中SPD升高可能因为Ⅱ型肺泡上皮细胞数量增加，或者肺部毛细血管损伤导致气血屏障通透性增加[22]。血清SPD和SPA水平升高提示肺泡上皮细胞损伤，但缺乏疾病特异性。SPD在多种结缔组织病合并ILD患者的血清中存在，如SPD诊断系统性硬化症合并肺间质病变的灵敏度约为81.5%，特异度约为75%[23]。Doyle等[24]研究发现血清SPD水平和RA-ILD相关。亚临床型和临床诊断为RA-ILD患者血清SPD水平高于对照组。此外，特发性间质性肺炎血清SPD和SPA水平升高和肺部损伤的严重程度相关，提示SPD和SPA是监测RA-ILD病情严重程度的潜在生物标志物[25]。

2.4 抗丙二醛-乙醛加合物抗体

丙二醛-乙醛加合物(malondialdehyde-acetaldehyde，MAA)是细胞氧化应激的产物。细胞膜脂质过氧化产生丙二醛和乙醛, 这两种具有高反应活性的醛类物质加和形成稳定的环状复合物MAA[26]。MAA修饰蛋白可促进炎症因子分泌，参与气道上皮细胞纤维化。在一项由1 742例RA患者和90例RA-ILD患者组成的研究中，结果显示RA-ILD患者血清中IgA和IgM型抗MAA抗体浓度较单纯RA患者的高。MAA在RA-ILD患者的肺组织高表达，和瓜氨酸、CD19+B细胞以及二型胶原共存，提示抗MAA抗体可能参与RA-ILD的致病过程，与RA-ILD自身免疫反应和炎症的发生有关[27]。体外试验也有相似的研究结果， 用MAA和环瓜氨酸共修饰蛋白免疫小鼠，可增加小鼠体内抗CCP抗体水平，促进单核细胞分泌IL-1β和TNF-α[28]。

然而，目前抗MAA抗体浓度的升高尚不能用于RA和其他风湿性疾病的鉴别诊断。系统性红斑狼疮和骨关节炎患者的血清抗MAA抗体阳性率为7%～74%，而RA患者的血清抗体阳性率为18%～80%[29]。有动脉粥样硬化，慢性气道炎症和酒精性肝炎等炎症反应的人群也可见抗MAA抗体水平的升高[30]。因此，需要更多的临床研究探讨血清抗MAA抗体在RA-ILD中的临床诊断价值。

2.5 抗瓜氨酸热休克蛋白抗体

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是细胞内分子伴侣，参与调控和维持胞内多种蛋白的结构和功能，在氧化应激、感染、高热等引起蛋白质发生错误折叠或聚集的情况下，HSP表达量增加[31]。热休克蛋白家族根据分子量大小进行分类，如HSP90的相对分子质量为90 000。一项纳入21例处于不同疾病进程的RA-ILD患者的临床研究发现，9名RA-ILD患者的支气管肺泡灌洗液中可检测到抗瓜氨酸HSP90抗体，而IPF组和健康对照组均无该抗体。对比支气管肺泡灌洗液和相应血清样本的抗瓜氨酸HSP抗体谱，结果显示肺部微环境有利于抗瓜氨酸HSP90抗体的表达，提示该抗体和肺组织病变存在关联，具有器官特异性[32]。Harlow等[33]发现抗瓜氨酸HSP 90α/β抗体诊断RA-ILD灵敏度为20%～30%，特异性为90%。抗瓜氨酸HSP90α/β抗体可以区分RA-ILD和无肺部病变的RA，提示该抗体是RA患者肺部病变的潜在生物标志物。

2.6 基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一类含锌金属钛酶，能够降解细胞外基质，在健康个体体内水平较低，而在组织愈合过程中上调表达。MMP7和MMP1参与细胞外基质重塑，可能在IPF的致病过程中发挥作用。Chen等[34]根据肺间质影像学异常类型和分布范围对RA患者进行评分：无ILD为0分，影像学怀疑为ILD但尚未确诊为1分，早期ILD为2分，晚期ILD为3分。结果显示1分组MMP-7水平较0分组明显升高，RA-ILD的MMP-7水平高于单纯RA，提示MMP-7对RA-ILD的早期诊断有一定价值。Dolye等[24]研究发现MMP7诊断RA-ILD的AUC为0.90，诊断性能优于RF(AUC=0.69)、抗CCP抗体(AUC=0.76)、肺活化调节趋化因子(AUC=0.69)和SPD(AUC=0.77)等RA-ILD相关标志物，说明血清MMP7水平升高有助于临床早期发现RA-ILD患者，预测病情进展。

3 RA-ILD预后评估相关标志物

3.1 肽基精氨酸脱亚胺酶

肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidyl-arginine deiminase，PAD)是一类钙依赖性半胱氨酸水解酶家族，包括PAD 1-4、6，具有催化精氨酸脱亚氨基产生瓜氨酸化多肽的功能。PAD在粒细胞、单核细胞和关节滑膜细胞等组织细胞中表达。RA患者血清抗PAD4抗体阳性率为29.7%，系统性红斑狼疮和系统性硬化症患者血清中未检测出抗PAD4抗体[35]。PAD2和PAD4存在于RA患者的关节组织和滑膜液，和关节损伤密切相关。血清抗PAD3/4交叉反应抗体阳性的RA患者，其关节损伤更严重、ILD的发病率高且病程更长[36]。抗PAD3/4交叉反应抗体可能通过增加PAD4对钙离子的敏感性，进而引起PAD4活性失调，在RA致病过程中发挥重要作用。Darrah等[37]发现抗PAD2抗体是RA-ILD患者预后较好的指标。与抗PAD2抗体阴性组相比，抗体阳性组肺间质病变发病率较低，关节损伤程度较轻。抗PAD抗体是RA-ILD的新型血清生物标志物，探究PAD和肺间质病变之间的关系，有利于评估患者预后，阐明RA-ILD的发病机制。

3.2 赖氨酰氧化酶样蛋白2

赖氨酰氧化酶样蛋白2(Lysyl oxidase-like 2，LOXL2)属于赖氨酰氧化酶家族，可催化胶原和弹性蛋白交联，维持细胞外基质稳定。LOXL2与成纤维细胞活化相关，具有促进器官纤维化的功能。已有文献报道LOXL2和IPF相关。Chien等[38]在IPF患者的血清中发现高滴度的LOXL2(>800 pg/mL)。免疫组织化学染色显示IPF患者的肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞可表达LOXL2[39]。Fu等[40]发现病程小于3个月的RA-ILD患者血清LOXL2水平明显高于病程大于3个月的患者，并且血清LOXL2水平和类风湿关节炎患者病情评价(DAS28评分)、CRP、RF及肺功能显著相关，提示LOXL2可能用于RA-ILD预后评估。

3.3 肺活化调节趋化因子

CCL18又称为肺活化调节趋化因子(pulmonary and activation-regulated chemokine，PARC)，是肺泡巨噬细胞分泌的趋化因子。CCL18可能在肺成纤维细胞持续纤维化过程中发挥作用。研究发现RA-ILD患者血清CCL18水平高于单纯RA患者，CCL18诊断RA-ILD的AUC为0.62[41]。在一项包含38例RA-ILD患者和30例无肺间质病变患者的临床研究中，好转出院患者支气管肺泡灌洗液中CCL18平均水平为8.27μg/L高于对照组的2.54μg/L(P<0.05)，RA-ILD死亡患者支气管肺泡灌洗液CCL18水平为18.28 μg/L高于好转出院患者(P<0.05)。此外，CCL18预测RA-ILD死亡患者AUC为0.860，说明RA-ILD患者支气管肺泡灌洗液中CCL18水平升高，可能与肺部病变严重程度以及住院期间预后相关，提示CCL18在RA-ILD预后评估方面具有一定临床价值[42]。

4 生物标志物的联合使用

生物标志物的联合使用能够提高RA-ILD的诊断灵敏度和特异性，便于RA-ILD和其他肺部疾病的鉴别诊断。联合使用MMP-7、SPD和CCL18三种生物标志物诊断RA-ILD可将AUC提高至0.92，并且有利于早期发现亚临床型RA-ILD患者。Dolye等[24]结合临床危险因素(年龄，性别，吸烟史)和RA-ILD相关自身抗体(MMP7、SPD和CCL18)建立风险预测模型，该模型诊断亚临床型RA-ILD特异性为92%，灵敏度为87%，阳性似然比为10.4，阴性似然比为0.15。Avouac等[41]组合KL-6、SPD和CCL18三种标志物，结果显示诊断灵敏度从68%提高至77%，特异性从83%提高至97%，优于单项生物标志物的诊断性能。White等[43]发现与间质性肺部疾病患者相比，IPF患者血清SPD，MMP7和骨桥蛋白水平均较高。三种血清标志物联合使用能够用于IPF和间质性肺疾病鉴别诊断，特别是区分特发性间质性肺炎的UIP和非UIP模式，但是考虑到年龄和影像学表现对诊断结果的影响，尚未发现IPF和RA-ILD 之间有显著差异。由此可见，与RA-ILD发病机制相关的生物标志物可能在RA-ILD的鉴别诊断中发挥一定作用。因此，还需要进一步临床研究发现组合标志物潜在临床价值。

综上，本综述从RA-ILD相关基因和自身抗体出发，总结并探讨RA-ILD相关生物标志物的临床价值。人类白细胞抗原基因、MUC5B启动子变异和家族性肺纤维化相关基因与RA-ILD存在关联，抗Carp抗体、SPD、抗MAA抗体、抗瓜氨酸HSP 90α/β抗体和MMP是RA-ILD风险预测的潜在生物标志物，PAD、LOXL2和CCL18可能用于RA-ILD危险分层和预后评估。尽管已有文献报道多种RA-ILD相关基因和自身抗体，但是缺乏兼顾灵敏度，特异性和危险预测等多个方面的标志物，并且部分自身抗体的检测方法尚未标准化，诊断价值缺乏足够的临床研究支撑。因此，还需要更多研究进行确认。