Cell：肾透明细胞癌的整合蛋白基因组学研究

姜依凡，郭 鹏 介评

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

近日，来自美国国家癌症研究所临床蛋白质组学肿瘤分析联合会(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC)的研究人员为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)开发了多组学方法，该方法结合基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，定义了可能有助于患者分层治疗的分子亚型[CLARK DJ,DHANASEKARAN SM,PETRALIA F,et al.Integrated proteogenomic characterization of clear cell renal cell carcinoma.Cell,2019,179(4):964-983,e31.]。

蛋白表达水平和信号通路的异常是肿瘤最常见的特征，近些年来的研究表明，相比于仅通过基因组分析，蛋白组和修饰组包含了更多基因无法识别的新信息，这一观察引出了蛋白基因组学的概念，综合多组学数据的分析能够更全面的认识肿瘤，也为肿瘤未来的精准治疗提供了新的思路和方向。

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是世界十大常见的癌症之一，其中75%为ccRCC并占据了RCC死亡的绝大部分，具有典型的Warburg表型。为了阐明驱动ccRCC功能模块失调的原因，CPTAC研究团队分析了103例未经治疗的ccRCC肿瘤样本以及80个配对的癌旁正常组织样本，使用质谱法鉴定了总共11 355种蛋白质和42 889种磷酸肽，其中所有样品中定量了7 150种蛋白质和20 976种磷酸肽，并将这些数据与全基因组测序、外显子组测序、总RNA测序和DNA甲基化进行结合分析。基因组分析确定了与基因组不稳定性相关的独特分子亚组，蛋白质组学的整合识别了受基因组改变影响的细胞机制蛋白质失调，包括氧化磷酸化相关的代谢、蛋白质翻译过程和磷酸化信号模块。

RCC分子亚型：基于RCC肿瘤微环境的细胞组成分析，并结合转录组学、蛋白质组学的基因表达富集特征和细胞信号传导分析，根据肿瘤免疫分型规则，CPTAC研究团队将ccRCC分为4个免疫分子亚型：①CD8+炎性；②CD8-炎性；③血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫缺乏；④代谢性免疫缺乏。CD8+炎性肿瘤展现出CD8+T细胞浸润程度高，免疫逃逸标记物PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4等基因表达上调，14号染色体缺失频率较高等特征。CD8-炎性肿瘤展现出天然免疫反应的特征，肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞较多，补体和凝血级联蛋白表达增加；并且，PDGFRA表达增加、细胞外基质和上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白丰富及癌症相关成纤维细胞基因表达等相关的“成纤维细胞签名”是CD8-炎性亚型独有的特征。VEGF免疫缺乏亚型与CD8-炎性有几个共同特点：间质评分增加、血管内皮细胞富集、血管生成信号增加；而在VEGF免疫缺乏亚型中，观察到SUMOyltation修饰增加(蛋白水平)，Wnt/β-catenin、RAP1、Notch信号通路上调(mRNA水平)等现象，与其“血管内皮细胞签名”表达水平最高一致。代谢性免疫缺乏亚型肿瘤中呈现低的免疫、间质和微环境评分，MYC靶基因表达上调，mTOR信号增加，和独特的代谢表现包括线粒体、氧化磷酸化和糖酵解蛋白增加。基于上述分子亚型对RCC患者癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)的预后进行分析发现，VEGF免疫缺乏亚型预后最好，而CD8+炎性亚型预后最差，表明这一分型系统可以有效预测RCC患者的预后，并暗示目前的靶向治疗方法比较适用于VEGF免疫缺乏亚型(血管生成最明显)，而其他亚型应使用针对其他靶点的治疗方式或免疫治疗方法。

磷酸化蛋白质组学分析激酶和底物调控途径：磷酸化影响多个细胞过程，其位点的占据受到其各自底物上激酶和磷酸酶活性的严格控制。作者分析了80个肿瘤/癌旁配对组织之间差异化的磷酸化肽丰度，确定CDK1和MAPK1(ERK2)在大多数肿瘤中是2个排名最高的磷酸化底物。此外，对细胞周期调控网络使用磷酸化底物进行更加深入的分析，发现与细胞周期S期进入/进展(CDK7-MCM2)和G2/M检查点(WEE1-CDK1)相关的磷酸化底物在大多数肿瘤中升高。在几乎所有的肿瘤中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)(MAPK的上游受体)的蛋白和磷酸化肽表达都上调，而VEGF受体则选择性表达与激活。而且，作者根据增加的磷酸化位点占位推断激活的信号通路，发现EGFR/VEGF的下游信号通路MAPK/ERK和AKT-mTOR在下游EIF4EBP1分子(一种重要的蛋白翻译调控分子)汇合，这一信号通路冗余可能解释临床应用的mTOR靶向抑制剂如依维莫司和坦罗莫斯为何疗效有限：因为肾癌细胞内过度活化的MAPK/ERK信号仍能激活EIF4EBP1分子。这一结果暗示同时靶向mTOR和MAPK/ERK的联合疗法可能更有效。纵向分析所有肿瘤样本中磷酸化肽丰度差异，研究人员鉴定出几种磷酸化肽共表达网络，包括细胞周期和血管生成2个不依赖于整体蛋白质组和转录组表型变化的模块。总体上，这种磷酸化蛋白组学分析鉴定了多种在肿瘤中活化的信号通路(如CDK7-MCM2、WEE1-CDK1和MAPK/ERK)，为在目前美国食品药品监督管理局批准的靶向VEGF和mTOR疗法之外扩大治疗选择范围提供了证据。

肿瘤分级与信号通路：肿瘤分级是ccRCC的重要预后指标，通常和肿瘤的分期、大小有关。多组学分析发现肿瘤分级与确切的信号通路相关。高级别肿瘤中，参与翻译、mTOR信号、EMT等通路的基因在mRNA和蛋白水平均上调，其他细胞通路则在转录组和蛋白组出现非协同性上调，如细胞周期调控和DNA修复的mRNA增加，而氧化磷酸化和N-糖基化修饰的蛋白增加。低级别的肿瘤表现出受体激酶、RAS、MAPK、Notch、RAP1信号通路等在mRNA和蛋白的增加，同时上调转录相关过程的蛋白表达。不同级别肿瘤信号通路的差异反映了肿瘤的不同需求，如高级别肿瘤需要适应基因组改变增加和肿瘤微环境的变化。

点评：总的来说，本研究报道了利用基因组、表观遗传组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组学等多种技术手段对ccRCC肿瘤进行大规模基因-蛋白-修饰组学分析，解释了基因组改变对功能的影响，发现很多单组学未能揭示的ccRCC重要特征，为从分子病理学角度精准选择治疗方案提供了重要依据。