青藏高原青稞抗白粉病SSR标记分析

杨春葆 刘仁健

摘要 [目的]研究青藏高原青稞抗白粉病机制。[方法]以青稞基因组数据为基础www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（accession no.SRA201388）设计200对SSR引物，标记关于抗白粉病基因位点并定位染色体。[结果]QK019和QK072两个SSR引物与抗白粉病基因HvNEWENTRY标记遗传距离较近，分别为58.2，81.4 cM，该基因位于6H染色体上。[结论]该研究可为青稞抗白粉病机制研究提供科学依据。

关键词 青稞;青藏高原;白粉病;SSR;遗传距离;染色体

中图分类号 S 512.3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）23-0137-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.037

Mapping of Resistance Gene to Powdery Mildew in Highland Barley on Tibetan Plateau Using SSR Markers

YANG Chun-bao1，2， LIU Ren-jian1，2

（1. State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement，Lhasa， Tibet 850002;2. Researh Institute of Agriculture， Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences， Lhasa， Tibet 850002）

Abstract [Objective]In order to study the resistance mechanism of Tibetan Plateau highland barley to powdery mildew. [Method]Based on the highland barley genome data submitted by this project www.ncbi.nlm.nih.gov/sra （accession no. SRA201388）， 200 pairs of SSR primer markers related to powdery mildew resistance gene locus were designed and locate the chromosome.[Result] The results showed that the genetic distance between QK019 and QK072SSR primers and the powdery mildew resistance gene HvNEWENTRY marker was 58.2 and 81.4 cM， respectively， and the gene was located on chromosome 6H. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for the study of resistance mechanism of highland barley to powdery mildew.

Key words Highland barley;Tibetan Plateau;Powdery mildew;SSR;Genetic distance;Chromosome

基金项目 西藏自然科学基金项目（XZ2019ZRG-87（Z））。

作者简介 杨春葆（1985—），男，黑龙江海伦人，助理研究员，硕士，从事青稞遗传育种研究。

通信作者，副研究员，硕士，从事青稞遗传育种研究。

收稿日期 2021-03-16

青藏高原青稞（Hordeum vulgare var.nudum），禾本科，大麦属，一年生草本植物，主要分布于西藏、青海、四川省甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州、甘肃省甘南藏族自治州以及云南、贵州的部分地区，适宜生长在高原清凉气候[1]，耐寒性强，生长期短，高产早熟，适应性广。青稞白粉病是由布氏白粉菌大麦专化型（Blumeria graminis f.sp.Hordei L.，Bgh）引起的真菌病害，其病原菌是专性的活体寄生菌，可引起青稞减产10%～20%，严重时可达30%以上，亦影响着青稞品质[2]，也是制约青稞优质、高产、稳产的因素之一。因此，筛选抗白粉病青稞品种（系）尤为重要。育种过程中，选育抗白粉病青稞品种（系）是防治白粉病最有效的途径。与白粉病抗性相关基因在小麦等作物中已得到功能验证，MLO、PBZ017、RPW8、MIEL1-V、CMPG1-V、PM15/21、M1IW6、SCL在麦类作物抗白粉病研究中得到功能验证[3]。小麦对白粉病的抗性存在单基因或者寡基因决定的质量抗性与由多基因控制的数量抗性2种形式，1粒小麦抗白粉病基因由1个隐性主效数量遗传性状（QTL）控制，被定位在Xcfd39/Xmag1491-Xmag1493区间，该基因与大麦MOL基因同源位点紧密连锁[4-6]。有研究發现，MOL基因隐性突变可提高大麦的抗白粉病能力，同时该基因对白粉病菌抗性具有广谱性[7]。lncRNA全谱解析青稞白粉病菌差异表达模式发现，钙依赖蛋白激酶、谷胱甘肽S-转移酶、纤溶酶原激活物抑制剂1、丝氨酸型内肽酶和MADS-box转录因子的编码基因表达水平较高，与青稞抗白粉病密切相关[8]。利用二粒小麦-普通小麦导入系，定位到来源于二粒小麦的抗白粉病主效QTL在普通小麦的4A染色体，同时该基因解释表型达54%以上。由此可见，麦类作物抗白粉病基因是一个复杂的主效基因控制的QTL[9]。

随着青稞基因组测序[10]的完成，已经筛选到与青稞抗白粉病相关基因，但相关基因定位的研究相对较少。该研究以青藏高原青稞为试验材料，用200对SSR引物初步定位抗白粉病相关基因位点，旨在为西藏抗白粉病青稞育种及栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗白粉病品系WDM03744與敏感品种藏青13号均来源于西藏自治区农牧科学院农业科学研究所，同时用于构建WDM03744×藏青13号杂交F2代群体，并用于QTL定位。

1.2 基因组DNA提取

将亲本及F2群体材料种植于每穴4 cm×4 cm的72穴长方形穴盘中。三叶一心取样期提取亲本及F2群体基因组DNA，CTAB法提取基因组DNA，并检测DNA含量，OD260/OD280为1.7～1.9为合格，-20 ℃存储备用。

1.3 引物选择合成

根据提交的青稞基因组数据设计200对SSR引物，与大麦耐盐性相关性状紧密连锁的标记对供试材料进行扩增。引物由Invitrogen公司合成，引物序列及PCR扩增程序见表1。

1.4 PCR扩增及银染

PCR扩增在PE9600（Perkin Elmer，Norwalk，CT，USA）PCR仪上运行。反应体系为12.5 μL，内含DNA模板10～20 ng，引物各2.5 pmol，d NTPs 2.5 nmol，MgCl2 18.7 nmol，0.2 U Taq DNA聚合酶与1×PCR缓冲液。反应程序：95 ℃ 1 min，然后按照94 ℃ 30 s，50～60 ℃（视引物而定）30 s，74 ℃ 30 s进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物在9%非变性聚丙烯酰氨凝胶上电泳分离，然后0.2%银染，0.15%NaOH显影（使用时加入5 mL/L甲醛）。

1.5 数据统计及遗传图谱构建

采用MAPMAKER/EXP 3.0b计算分子标记与抗病基因之间的遗传距离，用Mapdraw V2.1和MAPCHART2.2绘制抗病基因的分子标记连锁图。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性检测

利用www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（accession no.SRA201388）设计多态性抗白粉病SSR引物共 200对，并对双亲藏青13号（P1）与WDM03744（P2）进行多态性筛选，其中25对引物在双亲之间存在多态性，占引物总数的25%，部分引物的筛选结果见图1。

2.2 SSR标记遗传连锁图谱构建

抗、感亲本筛选表明，200对SSR引物中，有25对引物在亲本WDM03744与藏青13号表现出多态性。进一步利用这25对引物在抗、感池进行筛选，其中有5对（QK155、QK025、QK019、QK079和QK072）引物具有丰富的多态性。这5对引物在抗感小群体进行验证后发现，它们可以在抗病小群体和抗病亲本之间与感病小群体和感病亲本之间分别扩增出相同的特异条带，说明这5对引物相互连锁。根据NCBI提交青稞基因组数据，比对发现5对引物与HvNEWENTRY相互连锁。HvNEWENTRY基因位于6H染色体上，这5对引物标记该基因在6H染色体。

利用Mapmaker Exp 3.0计算遗传距离和MapDraw v2.1绘制遗传连锁图谱，结果显示，HvNEWENTRY及其连锁标记的位置顺序为QK155、QK025、QK019、HvNEWENTRY、QK079和QK072，其遗传距离见图2，HvNEWENTRY两侧连锁标记QK019和QK072的遗传距离分别为58.2、81.4 cM，遗传距离相较于其他较近。

3 讨论

麦类作物白粉病菌株具有群体大、变异快等特点，在单一抗源下，一旦出现新型病毒植株，抗病基因丧失，引起该种类型白粉病的广泛流行，造成作物减产[11]。国内外已鉴定出100余个抗小麦白粉病基因或QTL，其中已被正式命名的基因位点有100余个[12]。Pm4d、Mlm2033、Mlm80、Pm1b及pm2026是小麦主要的抗性基因，并在小麦中已得到定位。麦类作物中抗白粉病基因多为显性遗传，同时为主效基因控制[13]。目前虽然定位到的抗病性基因较多，但可有效用于生产上的抗病基因甚少。因此，不断挖掘新的抗白粉病基因，保持抗病基因抗源的多元化至关重要[14]。

抗白粉病种质资源的利用与发掘是提高作物抗病的主要途径及基本途径[15]。筛选到抗病性品种（系）是青稞抗白粉病研究的基础，以此构建群体，筛选更多的抗病材料有利于青稞产量栽培及推广。该试验定位到了与青稞抗白粉病基因HvNEWENTRY的位点，为后续开展抗白粉病机制研究奠定基础，设计的SSR引物较少，难以精细定位该基因，因此，后续需继续加强对抗白粉病基因的研究与定位。

西藏是青稞的主产地，不仅要加强对白粉病的防治力度，更要注重青稞产业发展，同时青稞也是藏族人民基本的粮食来源，研究青稞抗白粉病机制及提高青稞产量也是解决部分贫困地区粮食缺乏的一种有效方法。

4 结论

通过构建抗感池，检测200对抗白粉病基因SSR引物的多态性，其中只有25对引物具有丰富的多态性，以此为基础对青稞F2群体采用Mapmaker Exp 3.0计算遗传距离和MapDraw v2.1绘制遗传连锁图谱，其中QK155、QK025、QK019、QK079和QK072定位在HvNEWENTRY的两侧，该基因位于4H染色体上，其中QK019和QK072定位HvNEWENTRY基因遗传距离最近，初步可认为是该基因的粗定位SSR引物。

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