1例早发脑型肝豆状核变性家系ATP7B基因突变和临床表型分析

钱南南， 王久香， 裴 培， 杨 悦， 杨文明

肝豆状核变性(Wilson’s Disease，WD，MIM 277900)是一种常染色体隐性遗传的以铜代谢紊乱为特征的代谢性疾病，主要表现为肝功能异常、神经或精神损害、角膜可见K-F环(Kayser-Fleischer ring)甚至肾损伤。临床上，该病主要分为肝型(肝功能损伤)、脑型(神经精神异常)和混合型(二者都异常)。患者一般在5～35岁发病，儿童以肝型为主，脑型患者少见[1，2]。目前发现WD是由ATP7B基因突变所导致，我们对1例中国汉族早发型脑型WD家系进行ATP7B变异鉴定，以明确其遗传学病因，为该家系的疾病诊断提供遗传学证据，对家系其他成员的再发风险进行指导。

1 对象与方法

1.1 对象 先证者，女，13岁。2017年7月份渐出现口角流涎、言语不清，写字慢、字体歪斜。就诊于当地卫生所考虑“胃炎”，予口服药治疗未见好转(具体用药不详)。发病16 m开始出现左手不自主抖动，记忆力明显减退。患者双眼角膜K-F环阳性，脑部MRI显示双侧基底节区、黒质对称性异常低信号(见图1)，24 h尿铜 621.7 μg/d，ALT、AST、GGT和AKP正常，CER 0.093 g/L(参考值0.2～0.6 g/L)，考虑“肝豆状核变性”，予排铜、保脑等综合治疗后口角流涎及左手不自主抖动较前好转。患者4岁时患过病毒性脑炎。

表1 ATP7B外显子及其侧翼区PCR扩增引物序列

先证者脑部MRI显示双侧基底节区、黒质对称性异常低信号图1 先证者头部MRI

本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经中国合肥安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，本研究参与者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 EDTA抗凝管采集先证者及家系其他成员的外周血3 ml(见图2A)，全血基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA，并用分光光度计(Eppendorf，德国)检测其浓度和质量。

1.2.2 基因测序 利用Primer Premier 5 软件设计扩增包含ATP7B基因外显子及其外显子内含子连接区引物，由武汉擎科生物有限公司合成(见表1)。PCR体系(50 μl)：5X PrimeSTAR缓冲液(含Mg2+)10 μl (Takara)、基因组DNA 100 ng、上下游引物各0.2 μmol/L、dNTP Mixture 0.2 mmol/L(Takara)，PrimeSTAR DNA polymerase 0.5U(Takara)，用H2O补足至50 μl体系。PCR反应条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃ 变性10 s；55 ℃～60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物送武汉擎科生物有限公司用ABI PRISM 3100测序仪测序。测序结果与NCBI数据库中的ATP7B基因序列进行比对(见图2B-2E)。

2 结 果

ATP7B基因测序结果：外显子直接测序结果显示，先证者ATP7B基因存在c.2333G>T和c.2975C>T复合杂合错义变异(见图2C)，分别导致ATP7B第778位精氨酸变成亮氨酸，第992位脯氨酸变成亮氨酸。经检索HGMD数据库、dbSNP、千人基因组等数据库证实，c.2333G>T和c.2975C>T均为已知WD致病位点。先先证者母亲携带c.2333G>T(p.Arg778Leu)突变(见图2B)，先证者父亲携带c.2975C>T(p.Pro992Leu)突变(见图2C)。先证者的弟弟携带c.2333G>T(p.Arg778Leu)突变(见图2E)。

A：先证者家系图，箭头指示先证者；B～E：ATP7B测序结果(正向)，箭头指示变异位点图2 先证者家系及测序结果图

3 讨 论

WD是由于体内铜离子异常累积导致的一种罕见隐形遗传病。ATP7B是目前已知的WD致病基因，其定位于13q14.3，编码含有1465氨基酸残基的跨膜蛋白。铜离子的代谢障碍导致其在脑部、肝脏、眼底甚至肾脏累积，导致患者出现肝硬化、神经精神紊乱、角膜K-F环甚至肾损伤。因此早诊断、早治疗可减少患者肝、脑等组织的损伤，延缓病情进展，明显提高WD患者的生存质量，最终回归家庭和社会。患者自出生即存在铜代谢障碍，一般3岁以后才开始出现症状，临床表现各异且大部分为非特异性，因此早期诊断仍较为困难[3]。本文先证者发病初期口角流涎、言语不清，曾考虑胃炎，外院治疗后未见好转。发病4 m后，流涎、言语不清加重，开始出现左手不自主抖动。

目前ATP7B基因已经发现有600多个WD致病突变位点。H1069Q是目前中欧最常见的WD突变位点，在波兰、罗马尼亚，奥地利等中欧国家的等位基因频率为30%～60%[4]。R778L是日本、韩国、中国等亚洲患者的热点变异位点[5]。R778L等位基因在韩国WD患者的携带率约为 37.9%、日本约为27%，中国约28%～44%[4，6，7]。c.2975C>T(p.Pro992Leu)突变位于ATP7B第8外显子，蛋白的跨膜结构域。2013年，有学者报道了1例9岁的中国WD男童，携带与本文先证者相同的突变位点ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T[8]。该患者神经精神正常，本文中的先证者有明显的神经精神症状；角膜K-F环阴性，本文患者阳性；肝功能指标ALT(137 IU/L)、AST(106 IU/L)明显升高，本文先证者ALT(16 U/L，参考值5～35 U/L)、AST(22 U/L，参考值5～35 U/L)。有多位学者尝试寻找患者基因型和发病年龄、性别、临床表型的关系，但是没有明确的结论[9～11]。最新研究显示ATP7B DNA甲基化可能与患者临床表型相关[12]。此外先证者4岁时曾患有病毒性脑炎，是否与患者的早期发病相关亦未可知。

先证者的母亲携带ATP7B c.2333G>T突变，父亲携带c.2975C>T突变。先证者从双亲遗传到ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T符合杂合突变，结合患者临床症状、生化检查及体征，诊断WD明确。通过对先证者的弟弟ATP7B 基因21个外显子和外显子内含子衔接区的测序发现其只携带c.2333G>T突变，提示其弟弟的发病可能性不大，可密切随访观察。

我们报告了一例早发型脑型WD家系，明确该家系WD发病的遗传学基础是ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T，并对先证者的弟弟进行突变检测，分析其患病的可能性。