驱动基因阴性非小细胞肺癌患者新辅助免疫治疗手术后预后的影响因素

姚磊 颜巍 闫宇博 郭元杰 徐世东

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院1胸外科肺部病区，2消毒供应中心（哈尔滨 150081）；3阿勒泰地区人民医院胸外科（新疆阿勒泰 836500）

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是在肿瘤组织中存在的一群具有抗肿瘤作用的淋巴细胞群体，其中CD8+T细胞被认为是抗肿瘤免疫治疗中发挥主要作用的淋巴细胞［1-2］。现阶段研究认为，免疫抑制剂anti-PD-1、anti-PD-L1和anti-CTLA4可以增强TIL的抗肿瘤作用，而肿瘤组织中的CD8+T细胞的多寡可以在一定程度上反应免疫治疗的效果。生理情况下PDL1/PD-1通路可以维持机体的免疫耐受，避免免疫反应对正常组织造成过度伤害，而肿瘤细胞则会利用该通路产生抑制性的肿瘤微环境从而达到免疫逃逸，目前筛选免疫治疗获益人群的生物标记物非常有限，主要为PD-L1。TMB是预测是否使用免疫抑制剂的生物标志物之一，越来越多的临床研究开始关注TMB在非小细胞肺癌［3-5］、胃癌［6］和黑色素瘤［7-9］免疫治疗中的作用。因此TMB作为免疫治疗效果的独立预测指标，开始被众多临床研究纳入检测范围。我国肺癌的发病率和病死率均较高，为了更好的对肺癌进行治疗，如何选择理想的预测疗效的生物标记物是当前研究的热点。

1 资料与方法

1.1 患者纳入标准 收集并回顾性分析2015年1月至2020年12月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院术前接受过新辅助免疫治疗，且驱动基因为阴性的IIIa和部分IIIb非小细胞肺癌患者。纳入标准：（1）年龄：18 ～ 80岁，男女不限；（2）经病理学确诊为IIIa或IIIb期NSCLC，未接受过抗肿瘤治疗；（3）依据RECIST 1.1标准，患者至少具有1个可测量或评估的肿瘤病灶；（4）可进行手术切除；（5）组织样本经驱动基因检测为阴性；（6）拟应用新辅助免疫治疗。排除标准：（1）无病理学证据；（2）驱动基因阳性；（3）评判为无法切除；（4）曾接受过抗肿瘤治疗，如化疗、放疗、靶向治疗等；（5）混合癌或合并其他恶性肿瘤；合并重症肺炎或肺结核；（6）基础状况差，以下其一：ECOG PS评分＞1，KPS评分＜70，心功能不全（Ⅲ-Ⅳ级），肝功能不全（Child-Pugh C级），肾功能不全（4～5期）。对所有的患者信息进行整理并统计，患者一般情况见表1。

表1 患者临床病理特征Tab.1 The clinicopathologic characteristics of patients 例

1.2 患者样本检测 最终本研究共纳入51例肺癌患者，所有患者的肿瘤样本（蜡块中肿瘤组织＞0.5 cm3，或大标本8～10片，小标本15～30片）及血液（10 mL）进行448基因TMB检测，免疫组化检测 CD8（ThermoFisher，MA5-13473）和 PD-L1（ThermoFisher，14-5982-82）表达情况。所有患者均签署了知情同意书，并且本次实验得到了医学伦理委员会的批准。

1.3 结果评价 448基因TMB检测测序平台为illumina，把TMB数量≥25 mut/Mb定义为高突变组，其余为低突变组。对于病理结果的评价，邀请2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。采用半定量结果判定，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。每张切片上观察5个高倍视野（×400），计数阳性细胞百分比，阳性细胞数＜5%计为0分，5%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，76%～100%计为4分。阳性着色强度：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。两计分结果相乘即为最终评分。0～4分计为阴性（-），5～12分计为阳性（+）。若两医生评判结果出现不同，则由两人同时商议决定。

1.4 患者随访 患者随访主要以电话随访为主，手术后的1年内，每3个月随访一次，之后每6个月随访一次。随访工作严格按照我院的随访工作制度进行，随访之后详细记录患者的生存情况和无进展生存期（progression-free-survival，PFS）。

1.5 统计学方法 应用SPSS 24.0软件进行数据分析，生存分析使用Kaplan-Meier法作图，log-rank检验进行统计分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各指标亚组患者无进展生存期比较 根据患者的TMB和CD8、PD-L1免疫组化分析结果，结合患者的无进展生存期，对各指标亚组患者无进展生存期进行比较分析，结果见图1。PD-L1阳性组（PD-L1+）和PD-L1阴性组（PD-L1-）患者的无进展生存期无明显差别（P=0.461 1，图1A）。TMB高突变组（TMB）无进展生存期比TMB低突变组（TMB-）更长（P=0.004 7，图 1B），CD8阳性组（CD8+）无进展生存期比CD8阴性组（CD8-）更长（P=0.001 4，图1C），两者之间差异具有统计学意义。

图1 PD-L1、TMB和CD8各亚组患者无进展生存期比较Fig.1 Comparison of PFS in PD-L1，TMB and CD8 subgroups

2.2 多因素亚组分层后患者无进展生存期比较 综合患者的TMB、CD8和PD-L1表达情况，将患者分为PD-L1阳性/TMB高突变组（PD-L1+/TMB+）和其他（others），PD-L1阴性/TMB高突变组（PD-L1-/TMB+）和其他（others），CD8阳性/TMB高突变组（CD8+/TMB+）和其他（others），CD8阳性/PD-L1阳性组（CD8+/PD-L1+）和其他（others）。结合患者的无进展生存期，对各亚组患者无进展生存期进行比较分析，结果见图2。PD-L1+/TMB+患者较其他患者无进展生存期更长（P=0.001 9，图2A），PD-L1-/TMB+患者和其他患者无进展生存期无明显差异（P=0.361 1，图2B），CD8+/TMB+患者较其他患者无进展生存期更长（P=0.036 9，图2C），CD8+/PDL1+患者较其他患者无进展生存期更长（P=0.016 1，图2D）。本实验还将TMB高突变/CD8阳性/PD-L1阳性（TMB+/CD8+/PD-L1+）患者和其他（others）患者进行生存分析比较，TMB+/CD8+/PD-L1+患者较其他患者无进展生存期更长（P=0.037 7，图2E）。

图2 多因素亚组分层后患者无进展生存期比较Fig.2 Comparison of PFS between multifactorial subgroups

3 讨论

肺癌是当今世界病死率最高、发病率增长最快的恶性肿瘤之一，在我国约75%的肺癌患者在诊断时已属晚期，并且肺癌患者的肿瘤驱动基因阳性比率高［10］。按照现行治疗指南，对驱动基因阳性患者进行靶向治疗，患者受益更加明显。但目前并没有针对驱动基因阴性患者的靶向药，主要还是以铂类为基础的新辅助化疗以及免疫治疗为主，可是有效率也只有30%左右，而且化疗所产生的毒副作用，以及易产生耐药性而限制了其应用。免疫治疗的迅速发展，为驱动基因阴性患者的治疗提供了新的治疗方向。

随着免疫治疗研究的逐渐深入，肿瘤突变负荷等免疫相关概念逐步进入肿瘤治疗的应用范畴。RIZIVI等［11］研究表明，肿瘤突变负荷高的病人在使用免疫制剂治疗后，患者的总生存期和无进展生存期更长。临床Checkmate-026研究［12］中对应用Nivolumab的NSCLC患者进行回顾性分析，与化疗组相比，高TMB组（≥24.3 mut/Mb）的客观缓解率（Objective response rate，ORR）（46.8%vs.28.3%）和PFS（9.7 vs.5.8个月）均有所改善，并且病理缓解也与高TMB具有明显的相关性。目前认为在免疫治疗中，除了TMB与PD-L1表达之外，CD8+T细胞浸润情况与PFS相关，且具有预测抗PD-1免疫治疗疗效的作用。

CD8+T细胞可以作为预测癌症患者预后的独立指标，肿瘤中含有浸润性CD8+T细胞的患者生存率更高，在口咽癌［13］、肺癌［14-16］、胃癌［17］等癌症的研究中均得到了相同的结论。肿瘤细胞中PD-L1的表达促进了肿瘤反应性CD8+T细胞的浸润和增殖，增加了细胞因子的产生，并增强了细胞的溶解活性［18］。通过分析TCGA数据库发现，在RNA水平上，PD-L1高表达/CD8高表达亚组与新抗原生成显著相关［19］。患者在接受免疫抑制剂治疗后，免疫系统会生成更多CD8+T细胞。PD-L1阳性且CD8阳性患者比单一PD-L1阳性或CD8阳性患者更能从免疫治疗治疗中获益。在本实验中，未得到完全一致的结果，CD8阳性/PD-L1阳性组的P值小于单CD8阳性组，除去样本量较小的影响因素之外，可能是由于基于IHC方法检测肿瘤组织CD8+T细胞浸润的量化标准与RNA方法有一定差异性，但CD8作为独立危险因素，可以直接反应免疫细胞浸润程度，能够预测新辅助免疫治疗后患者的无进展生存期。

本研究发现，在使用新辅助免疫治疗后，患者术后的无病生存期与TMB和CD8相关。肿瘤组织中TMB高突变患者，肿瘤部分有明显炎性细胞浸润，会对肿瘤组织进行杀伤，并会杀伤患者循环系统中游离的肿瘤细胞，使患者获得较好的预后。而PD-L1阳性组和PD-L1阴性组在使用免疫抑制剂后并没有使患者获益。在TMB高突变的情况下，PD-L1阳性相较于PD-L1阴性，免疫治疗能更好的发挥作用，患者受益更加明显。当CD8阳性时，无论TMB或PD-L1表达情况如何，由于已发生免疫浸润，患者都能够获益，当CD8阳性/PD-L1阳性/TMB高突变的情况下患者受益更加明显。

综上，与单纯的PD-L1表达或CD8表达相比，免疫治疗后，CD8+T细胞浸润程度能够直接反应免疫治疗效果，而综合分析TMB和PD-L1双因素的组合能够更好的预测免疫治疗效果，得到较好的预后。这些发现对可手术切除的驱动基因阴性的NSCLC患者的PD-1/PD-L1阻滞治疗具有十分重要的指导意义。