经典瞬时受体电位通道3基因多态性与原发性高血压患者微量白蛋白尿的关系

沙热扎提·依沙江 王蒙蒙 李瑜 陈玉岚 孙晓靖徐新娟 张向阳

新疆医科大学第一附属医院1高血压科，2综合内二科（乌鲁木齐 830011）；3新疆医科大学第七附属医院重症医学科（乌鲁木齐 830063）

原发性高血压可引起心脑肾及血管等靶器官的损害，其中微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）是心血管疾病的预测因子和危险因素，是目前临床上应用最广泛的高血压早期肾损害筛查标志物之一［1-3］。MAU与高血压之间存在双向关联，i-SEARCH全球研究［4］显示全球高血压患者中MAU的总患病率为58.4%，另一项中国成年人纵向研究［5］发现MAU者患高血压风险增加75%。高血压MAU产生的潜在机制与肾小球滤过屏障中内皮细胞（endothelial cell，EC）的功能障碍有关［6-7］，而瞬时受体电位通道3（transient receptor potential channel，TRPC3）通过调节细胞内Ca2+浓度参与EC功能障碍的过程［8-10］，提示TRPC3可能与高血压产生MAU相关，TRPC3主要受控于TRPC3基因。本研究以原发性高血压患者为研究对象，评估TRPC3基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与MAU之间的相关性，以期为高血压早期肾损害的干预研究提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年4月至2017年12月于新疆医科大学第一附属医院高血压科住院并确诊为原发性高血压的患者449例，其中女143例，男306例；平均年龄（47.27±10.17）岁。纳入标准：（1）以《中国高血压防治指南2010年版》［11］为高血压诊断依据；（2）年龄18 ～ 65岁；（3）所选患者均为汉族，且患者之间无一、二级亲属关系；（4）经医学伦理委员会批准后，签署知情同意并且自愿参与该次研究患者。排除标准：（1）继发性高血压；（2）肾小球肾炎、肾病综合征、IgA肾病等肾脏疾病；（3）严重心、肝、肾功能不全；（4）血糖控制欠佳的糖尿病、甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症等内分泌系统相关疾病；（5）慢性消耗性疾病和恶性肿瘤；（6）目前口服肾毒性药物；（7）因各种原因无法配合完成该研究及临床资料不全者。

1.2 分组 根据是否合并微量白蛋白尿分单纯高血压组（EH组）378例和高血压合并MAU组（EH+MAU组）71例。MAU诊断标准：根据《中国高血压防治指南2010年版》建议，24 h尿微量白蛋白在30～300 mg为MAU。

1.3 研究方法

1.3.1 一般资料收集 包括入院时间、性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族史，测量身高、体质量，计算体质量指数（BMI）。

1.3.2 血液指标测定 所有研究对象禁食8 h，次日清晨抽取空腹肘静脉血，采用罗氏C8000全自动生化仪分析空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、胱抑素C、维生素D、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.3.3 尿微量白蛋白测定 患者正常饮食，当日清晨8点，排掉首次小便，此后每次小便全部留在清洁的容器中，次日清晨8点记录容器中尿量，摇匀后取留10～20 mL尿标本送检，采用贝克曼Dxc800全自动生化分析仪检测24 h尿微量白蛋白。

1.3.4 血压测量 采用美国welch Allyn动态血压监测仪6100监测，记录24 h平均收缩压（24 h SBP）、24 h平均舒张压（24 h DBP）、24 h平均脉压。

1.3.5 TRPC3基因多态性检测

1.3.5.1 DNA提取 采取清晨空腹肘静脉血5 mL，-70℃冷冻保存待测；按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明方法提取DNA；用紫外分光光度计测量DNA浓度和纯度。

1.3.5.2 PCR扩增分型 使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计TRPC3基因5个位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。采用多重PCR技术进行PCR扩增，PCR引物见表1。检测结果使用TYPER 4.0软件分型并输出结果。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primer

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验；采用Hardy-Weinberg检验比较两组间是否具有群体代表性，P＞0.05为符合Hardy-Weinberg平衡。应用logistic回归模型分析影响尿微量白蛋白的独立相关因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较 两组间年龄、BMI、甘油三酯、24 h平均收缩压、24 h平均舒张压差异有统计学意义（P＜0.05），具余指标差异均无统计学意义（P ＞0.05），见表2。

表2 EH组与EH+MAU组一般临床资料对比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

表2 EH组与EH+MAU组一般临床资料对比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

年龄（岁）男［例（%）］吸烟史［例（%）］饮酒史［例（%）］家族史［例（%）］高血压病程（月）BMI（kg/m2）空腹血糖（mmol/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）甘油三酯（mmol/L）总胆固醇（mmol/L）高密度脂蛋（mmol/L）低密度脂蛋（mmol/L）维生素D（nmol/L）同型半胱氨酸（μmol/L）胱抑素C（mg/L）24 h平均收缩（mmHg）24 h平均舒张（mmHg）24 h平均脉压（mmHg）EH组（n=378）47.77±10.05 251（66.40）151（39.95）143（37.83）257（67.99）62.03±73.15 26.27±3.22 4.84±0.92 5.26±1.37 71.01±15.79 1.90±1.35 4.23±0.89 1.13±0.30 2.80±0.73 36.42±17.07 14.32±8.00 1.63±14.94 133.66±13.13 84.42±11.28 49.24±8.28 EH+MAU组（n=71）44.58±10.45 55（77.46）34（47.89）27（38.03）48（67.61）74.73±78.95 28.02±3.92 4.96±1.26 5.38±1.37 72.92±18.87 2.57±2.74 4.16±0.87 1.07±0.28 2.67±0.69 34.91±23.23 14.53±8.58 1.02±1.29 144.27±16.85 93.09±13.00 51.18±8.49 P值0.015 0.072 0.238 1.000 1.000 0.186＜0.001 0.352 0.484 0.365 0.046 0.534 0.125 0.190 0.538 0.843 0.734＜0.001＜0.001 0.072

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验（P＞0.05），具有群体代表性。

2.3 EH组与EH+MAU组基因频率的比较 两组rs953691位点基因型分布、等位基因及显性模型（GG/GT+TT）差异有统计学意义（P＜0.05），余位点基因型分布及各模型差异均无统计学意义（P ＞0.05），见图1。

图1 EH组与EH+MAU组基因频率分布Fig.1 Frequency distribution of EH group and EH+MAU group

2.4 Logistic回归分析 以MAU为因变量，年龄、BMI、甘油三酯、24 h平均收缩压、24 h平均舒张压和TRPC3基因rs953691显性模型基因型为自变量，进行logistic回归分析，结果显示：甘油三酯、24 h平均收缩压（≥150 mmHg）和rs953691 GG基因型为原发性高血压患者出现MAU的独立危险因素，见表3。

表3 原发性高血压患者微量白蛋白尿影响因素的logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of factors influencing microalbuminuria in essentialhypertension patients

3 讨论

TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一个亚群，主要受控于TRPC3基因。人类TRPC3基因由位于4号染色体上的13个外显子组成。近年大量研究成果已证实，TRPC3在肾小管、肾间质、肾上皮及脉管系统中表达并参与不同类型的肾脏疾病。在慕尼黑大鼠肾皮质中TRPC3表达增高，且与蛋白尿有关［12］；敲除TRPC3基因可改善梗阻肾引起的肾小管间质损伤和肾纤维化［13］；另外，联合敲除TRPCs（包括TRPC3）可降低糖尿病小鼠肾功能不全的易感性［14］。然而TRPC3基因多态性在原发性高血压肾损害中的作用尚不明确。

本研究结果显示，EH+MAU组患者BMI、甘油三酯、24 h平均血压水平明显高于EH组，与RAIKOU等［15］、KUANG等［16］结果一致。Logistic回归显示，排除混杂因素后甘油三酯和24 h平均收缩压（≥150 mmHg）仍是原发性高血压合并MAU的独立危险因素。另外发现，EH+MAU组患者较EH组年龄小，与AL-SHARIFI等［17］研究结论相反，可能原因考虑：（1）EH+MAU组更高的血压、血脂、BMI水平使患者更早出现MAU。（2）AL-SHARIFI等［17］研究纳入的病患为伊拉克人群，而本研究为中国汉族人群，这种差异可能与地理区域和遗传因素相关；（3）AL-SHARIFI等［17］研究，患者平均年龄（59.0±7.2）岁，而本研究患者平均年龄为（47.27±10.17）岁，抽样人群年龄差异可能导致研究结果不一致。因此，在强调血压、血脂达标的基础上，更好地控制体质量是预防高血压患者MAU的重要策略之一。

TRPC3的5个位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明具有群体代表性。基因频率的比较结果显示，rs953691位点基因型、等位基因及显性模型在两组之间存在统计学差异，推测rs953691位点的变异可能是高血压合并MAU的危险因素。进一步行logistic回归分析显示，TRPC3基因rs953691位点GG基因型的高血压患者发生微量白蛋白尿的风险性是GT+TT基因型的2.169倍，提示TRPC3基因多态性是高血压合并MAU的独立危险因素。可能机制如下：（1）TRPC3在高血压患者内皮细胞中高表达，其诱导的Ca2+作用于内皮骨架中的肌球—肌动蛋白，引起内皮细胞膜流动性增加进而破坏肾小球滤过屏障的结构和功能［9，18］。（2）TRPC3参与 RAAS 系统激活并释放血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）［19］，AngⅡ损伤肾小球内皮细胞、系膜细胞，打破肾血管自我调节能力，引起肾小球高压力、高滤过［20］。（3）TRPC3 通过 Ca2+介导的信号调节激酶控制肾成纤维细胞增殖、分化和活化，使肾间质纤维化和肾小管损害，进而加重肾损伤［21］。

综上所述，高血压早期出现MAU是环境和遗传因素共同影响的结果。血压、甘油三酯和TRPC3基因多态性是高血压患者MAU的独立风险因素。TRPC3基因rs953691位点的GG基因型可能增加高血压患者MAU发生的风险。进一步深入研究TRPC3基因的功能和作用机制可以为高血压患者MAU的早期诊断及有效防控提供理论依据。

本研究新颖之处：探讨TRPC3基因多态性与原发性高血压患者MAU的关系，明确了rs953691位点的GG基因型与高血压患者MAU具有相关性，为高血压早期肾损害的干预提供了新思路。不足之处：本研究对象全部来自同一家医院的住院患者，可能存在选择偏移，此外本研究样本量较小，未设健康对照组。下一步研究方向：纳入健康人群，扩大样本量，对研究对象进行长期随访和多中心研究，进一步行动物实验验证。