黏膜相关恒定T细胞比例与慢加急性肝衰竭患者预后的关系

薛红 李晗 田李均 邵建国 卞兆连

南通大学附属南通第三医院1重症感染科，2重症医学科，3消化科（江苏南通 226006）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指在既往已知或未知的慢性肝病基础上出现急性肝功能损伤，以腹水、黄疸、门脉高压等症状为主的临床综合征［1］，预后差，病死率高（50%～90%）［2］。因此，早期识别肝衰竭患者的不良预后，对临床治疗、减少并发症具有重要意义［3］。

黏膜相关恒定T（mucosal associated invariant T，MAIT）细胞是一类独特的先天性T细胞，它们在黏膜组织和外周血中大量存在，在人类肝脏中高度富集［4］。笔者前期研究表明［5］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝衰竭患者MAIT细胞明显减少。然而，非HBV感染肝衰竭患者MAIT细胞变化并不清楚。因此，本文将对ACLF患者MAIT细胞变化及其预测预后价值进行研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年9月至2019年9月在南通市第三人民医院住院的51例ACLF患者资料。其中男33例，女18例，平均年龄（49.29±11.38）岁。所有患者均予保肝退黄等内科综合治疗，依病情需要给予人工肝、持续血液滤过治疗。ACLF诊断标准参照肝衰竭诊治指南（2018年版）［6］：凝血酶原活动度≤40%（或国际标准化比值≥1.5）；血清总胆红素水平超过10倍正常值或每日上升≥17.1 μmol/L。根据不同慢性肝病基础分为3型，A型：在慢性非肝硬化肝病基础上发生的ACLF；B型：在代偿期肝硬化基础上发生的ACLF；C型：在失代偿期肝硬化基础上发生的ACLF。纳入标准：（1）ACLF患者；（2）年龄＞18岁；（3）临床资料完整。排除标准：（1）妊娠或哺乳期 妇女；（2）合并HIV、结核感染；（3）患有原发性肝癌或其他恶性肿瘤；（4）合并严重肺、心脏或其他器官障碍的患者。收集同期医院体检中心健康体检者作为对照组（n=30）。研究方案获得南通市第三人民医院伦理委员会批准（批号EL2018002）。

1.2 试剂 淋巴细胞分离液（Ficoll-pague）购自美国GE公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，PBS缓冲液及胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，CD3、CD161、Vα7.2抗体购自美国Biolegend公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有ACLF患者和健康对照者均空腹6～8 h，行血常规、炎症指标等生化检测。MELD评分计算公式：MELD评分=9.6×ln［SCr（μmol/L）］+3.8×ln［TBIL（μmol/L）］+11.2×ln（INR）+6.4×（胆汁或酒精性肝硬化为0，其他病因为1）［7］。

1.3.2 外周血单个核细胞的分离 采集外周血5 mL，血样6 h之内通过密度梯度法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。20℃3 000 r/min离心10 min，收集浅黄色涂层界面层添加到装有3 mL Ficoll的15 mL离心管中，然后，将离心管在860rcf和20℃条件下离心30 min，用PBS缓冲液洗涤后，在300rcf下离心10 min收集PBMC，并将其放在有10%二甲基亚砜的胎牛血清中，存入液氮以供进一步分析。

1.3.3 流式细胞术检测MAIT细胞的比例 将CD3、CD161、Vα7.2抗体进行滴定后按适当比例混合，每1×106个PBMC中加入50 μL混合抗体，室温、避光染色30 min。根据文献［8］定义外周血MAIT细胞表型：CD3+CD161+Vα7.2+。流式细胞术分析用流式细胞仪（BD Biosciences）进行。数据分析采用FlowJo软件。检测MAIT细胞占CD3+T细胞的比例。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析。计数资料以例数和百分数表示，比较采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，采用非配对t检验。使用二元logistic回归分析ACLF患者预后的危险因素。采用Kaplan-Meier绘制生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 ACLF组和对照组在性别、年龄、白细胞计数和淋巴细胞计数方面差异均无统计学意义（P＞0.05）；ACLF组患者谷丙转氨酶、天门冬氨酸转氨酶和总胆红素显著高于对照组，白蛋白和血小板计数显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 对照组和ACLF组基线资料比较Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

表1 对照组和ACLF组基线资料比较Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.001；“-”无相关数据；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；TBIL，总胆红素；ALB，白蛋白；PLT，血小板；PT，凝血酶原时间；INR，国际标准化比值；PTA，凝血酶原活动度；CRP，超敏C反应蛋白

项目例数年龄（岁）性别（男/女）ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）前白蛋白（mg/L）胆碱酯酶（U/L）PT（s）INR PTA（%）白细胞计数（×109/L）淋巴细胞计数（×109/L）血小板（×109/L）肌酐（μmol/L）CRP（mg/dL）对照组30 45.30±15.01 16/14 15.87±5.53 21.77±5.25 12.67±3.65 43.23±2.59 χ2/t值--1.340 1.022-4.124-4.296-11.120-21.795 P值-0.184 0.312 0.000 0.000 0.000 0.000---------------5.98±1.79 2.54±0.81 192.90±46.39-0.833 0.241 8.056 0.407 0.810 0.000--ACLF组51 49.29±11.60 33/18 480.71±615.71 419.12±505.28 319.60±135.76 30.78±3.59 64.00±35.73 2 949.25±1 404.36 24.89±8.34 2.19±0.75 30.83±9.08 6.66±4.19 2.35±4.23 98.75±53.18 88.53±130.54 15.53±16.51----

2.2 两组外周血中MAIT细胞的比例比较 从流式FSC/SSC散点图中圈出淋巴细胞，然后选取CD3+细胞设门，再选择CD3+CD161+Vα7.2+细胞作为MAIT细胞（图1A）。ACLF组的MAIT比例为（2.03±1.19）%，而对照组MAIT比例为（5.07±1.22）%，明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），见图1B。

图1 ACLF患者及对照组外周血中MAIT细胞的比例比较Fig.1 Comparison of MAIT cell proportion in peripheral blood between ACLF patients and controls

2.3 肝衰竭患者病毒组与非病毒组外周血MAIT的比例 根据病因将ACLF患者分为病毒感染组（n=42）和非病毒感染组（n=9），结果表明，两组间MAIT细胞比例差异无统计学意义［（2.08±1.27）%vs.（1.82±0.81）%，P ＞0.05］，提示ACLF患者外周血MAIT细胞比例与病毒感染无关。见图2。

图2 ACLF患者病毒组和非病毒组患者MAIT细胞的比例Fig.2 The proportion of MAIT cells in viral and non viral patients with ACLF

2.4 不同慢性肝病基础的ACLF患者外周血MAIT细胞的比例 根据慢性肝病的不同基础情况，将ACLF患者分为3型A型（n=11）、B型（n=9）和C型（n=31）。比较各组MAIT细胞的比例，结果显示与A型患者（n=11）相比B型和C型患者（n=40）的MAIT细胞比例低［（1.69± 0.84）vs.（3.29±1.49），P＜0.001，图3A］。此外，与A型患者相比C型患者的MAIT细胞比例较低［（1.54±0.80）vs.（3.29±1.42），P＜0.001］，C型患者与B型患者相比之间存在差异［（1.54±0.80）vs.（2.18±0.80），P＜0.05，图3B］。

图3 不同慢性肝病基础的ACLF患者外周血MAIT细胞的比例Fig.3 Proportion of peripheral blood MAIT cells in patients with ACLF based on different chronic liver diseases

2.5 影响ACLF患者预后的单因素分析 根据出院后90 d的随访转归分为好转组和死亡组，其中好转组30例，死亡组21例。将影响肝衰竭预后因素如MAIT细胞比例、性别、年龄、总胆红素、白蛋白、血小板计数、PTA、肌酐、MELD评分等进行单因素二分类logistic回归分析，结果显示MAIT细胞比例、年龄、PTA和MELD评分与ACLF预后有关（P＜0.05），见表2。

表2 ACLF患者预后的单因素logistic回归分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of prognosis in patients with ACLF

2.6 影响ACLF患者预后的多因素logistic回归分析 将MAIT细胞比例、年龄、PTA、MELD评分纳入多因素logistic回归，结果显示MAIT细胞比例、MELD评分为ACLF患者预后的危险因素（P=0.015、P=0.021），见表3。

表3 影响ACLF患者预后的多因素logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis on prognosis of patients with ACLF

2.7 不同MAIT细胞比例ACLF患者预后的比较以ACLF患者外周血MAIT比例的中位数作为分界值（1.96%），将ACLF患者分为高MAIT组（≥ 1.96%26例）和低MAIT组（＜1.96%25例），采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。MAIT≥1.96%生存率为80.77%，而MAIT＜1.96%则为36.00%，高MAIT组患者的生存时间明显高于低MAIT组，两组差异有统计学意义（P=0.000 3），见图4。

图4 不同MAIT细胞比例ACLF患者90 d生存曲线分析Fig.4 Analysis of 90 day survival curve of ACLF patients with different MAIT cell ratios

3 讨论

ACLF患者肝组织中大量的肝细胞坏死引起炎症反应过度激活导致全身炎症反应综合征，致使肝外多器官衰竭［9］。几乎所有类型的免疫细胞都会发生不同程度损伤，包括中性粒细胞、树突状细胞、骨髓源性抑制细胞和自然杀伤细胞［10］。SHEN等［11］报道T细胞介导的免疫损伤在乙型肝炎病毒相关ACLF的发病机制中起重要作用。

MAIT细胞是一种进化保守的T细胞，是人类免疫系统的重要组成部分。最近的一项研究还发现，MAIT细胞可能参与新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的免疫发病机制［12］。在NAFLD患者［13］及严重酒精性肝炎患者［14］较健康对照组相比，MAIT细胞频率降低。然而，ACLF患者MAIT细胞免疫功能的改变尚未见报道。在本研究中，通过流式细胞术发现ACLF患者MAIT细胞比例较对照组严重降低，这与既往研究［4］一致。由于缺乏ACLF患者的肝脏标本，故无法通过流式细胞术方法确定ACLF患者肝脏中MAIT细胞比例是否较对照组升高，需要进一步开展动物实验来判断MAIT细胞是否在肝脏部位聚集。慢性乙型和丙型肝炎病毒是引起肝脏疾病最重要的原因，在不同的病毒感染（如HBV［15］和HCV［16］感染）同样会导致MAIT细胞水平的显著降低，笔者推测MAIT细胞的变化可能与ACLF的病因无关。为了明确MAIT细胞的变化是否与病毒感染有关，本研究比较病毒感染和非病毒感染患者的MAIT细胞比例，发现两者之间没有差异，说明ACLF患者外周血中MAIT细胞的变化确实与病毒感染无关。近期一项研究［17］发现失代偿期肝硬化患者MAIT细胞水平降低，由于晚期肝硬化患者对感染的易感性增加，作为肝硬化相关免疫功能障碍的一部分，MAIT细胞具有对细菌的应答能力。本研究观察到B型和C型ACLF患者MAIT细胞比例比A型患者明显下降，而且C型ACLF患者的MAIT细胞比例也比B型患者低。结果表明C型ACLF患者MAIT细胞比例较低，提示外周血MAIT细胞水平可能与ACLF患者慢性肝病的不同基础情况密切相关。

ACLF患者尚缺乏预测其预后的生物标志物，因此寻找一种更准确、更方便的预后标志物显得尤为重要。目前用于肝衰竭短期预后的评价有MELD评分、序贯器官衰竭评估模型等［18］，但过于复杂，应用价值有限。为验证外周血MAIT细胞水平是否可以预测ACLF预后，本研究多因素logistic回归分析，结果显示MAIT细胞比例是ACLF患者死亡的危险因素（P=0.015），潜在的机制尚未完全确定。进一步按照MAIT比例的中位数分为高表达组和低表达组，生存曲线分析MAIT≥1.96%组患者生存率为80.77%，而MAIT＜1.96%则为36.00%（P=0.000 3），进一步提示了MAIT细胞水平预测ACLF患者90 d预后的价值。

综上所述，本研究表明，较低的MAIT细胞水平可能预示着ACLF患者的预后较差，提示MAIT细胞是预测ACLF预后的重要标志物。MAIT细胞的耗尽可能导致免疫抑制，增加机会性感染的风险，从而导致严重的后果。本研究存在一些局限性：样本量较少，仅为单中心研究。期望今后能够通过大样本，多中心研究进行验证，将来成为ACLF免疫治疗的靶点。