虚拟筛选研究Islatravir衍生物抗新型冠状病毒RdRp潜力

汪 燕，吴潇然，刘晓玲

（黄山学院 化学化工学院，安徽黄山 245041）

SARS-CoV-2自从2019年发现以来，病例数量呈指数增长，在全球造成了巨大的人员伤亡和经济损失[1-2]。SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒正链包膜β冠状病毒，RdRp是它的一种重要结构蛋白。SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞后，基因组会被释放到细胞质中，病毒的RNA会与宿主细胞的核糖体结合，开始翻译RdRp和解旋酶，并形成复制-转录复合体，该复合体通过疏水域附着在宿主细胞的内质网上，合成亚基因组的mRNA，产生结构蛋白和辅助蛋白[3-5]。由核衣壳蛋白（N）和基因组RNA组装而成的螺旋核衣壳与其他结构蛋白相互作用，形成组装的病毒体，最后通过胞吐作用释放到细胞外区室[6]。

由此可见，SARS-CoV-2的RdRp在病毒的转录复制中起到关键作用，寻找合适的小分子抑制剂即可阻止病毒的自我复制[7-8]。通过对新冠病毒基因组序列的最初分析表明，新冠病毒众多病毒酶的催化位点具有保守性，与SARS和MERS中的酶具有高水平的序列相似性，因此根据老药新用原则，市面上的抗病毒药物核苷逆转录酶抑制剂有可能对病毒的RdRp起到抑制作用，该类药物属于RdRp底物的竞争性抑制剂，药物分子磷酸化后掺入病毒的RNA链，阻断RNA链的进一步合成，从而达到终止病毒自我复制的目的[9-11]。

Islatravir（EfdA，MK-8591）是一种新型的以腺嘌呤核苷为基础的核苷逆转录酶易位抑制剂，在临床前研究中显示出巨大的前景，包括卓越的效力和较长的细胞内半衰期，具有独特的结构和较高的抗病毒活性，目前正用于抗病毒治疗[12-13]。Islatravir与抗病毒活性药物瑞得西韦同属于核苷类药物，具有一定的结构相似性。目前文献报道中，瑞德西韦与RdRp靶蛋白的结合作用被科研工作者广泛研究[14-16]。基于此，推测Islatravir能与SARS-CoV-2的RdRp蛋白具有良好的结合性，从而抑制SARS-CoV-2复制[16]。参考瑞得西韦分子在体内的代谢方式[17-18]，Islatravir在细胞内被2-脱氧胞苷激酶转化为具有抗病毒活性的三磷酸盐，通过对天然底物三磷酸脱氧核苷的竞争来发挥抑制作用，Islatravir的三磷酸活性结构，简称Triislatravir，如图1所示。

图1 Tri-islatravir的生成及三类修饰位点

本文选择RdRp为靶标蛋白，构建了Tri-islatravir配体衍生物分子库，通过D3Targets-2019-nCoV 平台的分子对接技术，对Islatravir类配体进行了虚拟筛选，探讨了Islatravir衍生物抗病毒的潜在价值，为筛选和开发抗冠状病毒活性结构提供参考，也为我们后续进行潜在活性分子的化学合成工作提供了研究基础。

1 试验部分

1.1 数据和工具

PDB 数据库（RCSB Protein Data Bank）；Islatravir类分子配体库；D3Targets-2019-nCoV 平台；Pymol；Chemof fice suite 2019；Discovery Studio等。

1.2 Islatravir类配体库设计与构建

应用于虚拟筛选的小分子配体应具有多样性，在Tri-islatravir结构基础上选取三个修饰位点，如图1所示；设计了三类配体衍生物：Ⅰ类改造是对磷酸基团与碱基母核的连接处进行改造，例如引入醚键、双键或者增加碳链长度等；Ⅱ类改造是以骨架跃迁的方式对碱基母核进行改造，并引入氰基、烷基、硝基。Ⅲ类是对碱基母核上裸露的氨基进行取代，例如还原胺化得到烷基氨，酰胺缩合得到酰胺等。

如图2所示，选取21种Tri-islatravir改造衍生物，将其分子结构绘制在Chemof fice suite 2019中，进行能量最小化处理，导出为mol2格式文件，为平台对接备用。

图2 Tri-islatravir衍生物配体库的设计

1.3 分子对接计算

本文应用D3Targets-2019-nCoV 平台进行对接运算[19]。进入平台后，在功能区D3Docking下的VirtualScreening模块进行以下操作：

（1）设置任务标题；

（2）上传配体文件（格式为.sdf或.mol2）；

（3）选择靶标蛋白RdRp；

（4）平台运行计算，输出对接结果。输出文件为Islatravir分子在RdRp靶蛋白不同口袋处结合的能量最低构象和打分结果。筛选打分最高构象，利用Pymol和Discovery Studio进行可视化处理，如图3所示。

图3 D3Targets-2019-nCoV的D3Docking功能：输入（左）和输出界面（右）

2 结果与讨论

2.1 Islatravir与RdRp结合模式分析

D3Targets-2019-nCoV平台将Tri-islatravir与RdRp活性位点进行了对接，选取最高对接得分（-12.31 kcal/mol）的结合口袋1（Pocket 1）处的对接复合物，可视化处理后的结果显示，在图4中，A图是靶标蛋白RdRp的结构，B图中绿色网格线部分表示Pocket1所在位置，C图是Tri-islatravir三维结构，D图显示了RdRp的活性结合口袋1表面是明显的凹槽状，Tri-islatravir的分子结构与口袋1具有良好的适配性，能有效嵌入口袋，形成结构稳定的复合物。

图4 Islatravir与RdRp的结合模式：

根据对接复合物能量最低构象的3D图（E）和2D（F），Tri-islatravir与 RdRp在 Pocket1处 的 结合 作 用 力 有 ：Tri-islatravir与 ASN691、SER759、THR687、U20、GLU811、SER814产 生 了Conventional Hydrogen Bond作用，主要由核苷和三磷酸结构上的N、O原子形成；与ALA688、U20、SER682产生Carbon Hydrogen Bond作用；与RdRp上镁离子MG1004、MG1005和MG1006均产生了Metal-Acceptor作用；Tri-islatravir的核苷结构与残基U20产生了Carbon Hydrogen Bon和Halogen（氟）作用；Tri-islatravir的C≡C结构与ARG555产生了π-烷基疏水相互作用。此外，Tri-islatravir与ASN-691间还存在unfavorable donor-donor作用，属于不利作用力。

以上看出，芳香碱基上，三磷酸侧链及连接处与受体蛋白作用力类型较少。Tri-islatravir与RdRp结合力最主要的为Conventional Hydrogen Bond和Metal-Acceptor作用。考虑Metal-Acceptor作用由RdRp上的Mg离子主导，且三磷酸活性分子结构是Islatravir在体内的代谢形式，Metal-Acceptor为固定作用力，因此主要从增强Conventional Hydrogen Bond作用的角度出发，进行骨架和药效团的改造，以提高Triislatravir衍生物与RdRp的结合效果。

观察Hydrogen bond的电子供体受体图（E），碱基母核的五元环和N3区域周围主要作为电子受体的氨基酸残基，如果基于蛋白配体的适配性来改造Triislatravir结构，应该在Tri-islatravir上的对应区域引入氢键供体基团；C4和N7区域周围则是电子供体的残基，在这里应该引入氢键受体基团，以增强小分子配体与周围残基的结合。

另外，参考市面上的小分子RdRp抑制剂的药效团和活性结构，进行修饰和改造，也是一种Islatravir衍生改造的途径。

2.2 Islatravir衍生物和RdRp的构效关系分析

将图2中设计的Tri-islatravir衍生物配体提交至D3Targets-2019-nCoV平台，与靶标蛋白RdRp进行分子对接运算，对接结果显示Pocket 1处得分最高，推测口袋1是核苷类药物与新冠病毒RdRp的最佳结合位点。21种Tri-islatravir衍生物配体的对接得分如表1所示。

从表1可以看出，Tri-islatravir三类衍生物得分整体差值不大，其中有9种衍生物（衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4、衍生物5、衍生物9、衍生物12、衍生物15、衍生物20）得分优于Tri-islatravir（-12.31 kcal/mol）。改造方式分别是，Ⅱ类是通过骨架跃迁引入官能团对碱基母核进行改造，Ⅲ类是对碱基母核上的氨基进行多种取代。

表1 Tri-islatravir衍生物与RdRp口袋1的对接得分

结合对接得分发现，Ⅰ类改造明显提高了结合力影响，改造方式是在侧链连接处引入单个官能团或原子，对整个分子结构和空间位阻影响最小。Ⅱ和Ⅲ类组别内衍生物得分差异较大。Ⅱ类改造方式是通过骨架跃迁和引入官能团对碱基母核修饰，该类改造中大部分衍生物引入基团的分子量或构象变化较小，对接得分也与Tri-islatravir接近。其中有四个衍生物6、7、8和9，引入基团分子量较大，会明显增大衍生物的空间位阻。而衍生物9由于引入的是环戊烷结构，具有共轭效应。因此衍生物6～8的对接得分明显减小，而9略有增加。Ⅲ类改造中，对碱基母核上的氨基进行多种取代，当取代基团分子较大时，也会增大衍生物空间位阻，使得结合力减小。与衍生物9类似的衍生物20，由于取代了芳香基团，存在共轭作用力，因此对接得分明显增加。

综上，Ⅰ类改造对分子构象影响最小，更容易提高结合力，而Ⅱ和Ⅱ类改造会影响分子的空间结构，基于引入的不同官能团，改造的衍生物具有不同的结合效应。选择每个类别得分最高的衍生物，对其与RdRp的Pocket 1处结合模式进行分析。

2.2.1 Ⅰ类配体衍生物

衍生物3得分最高。它的衍生途径是在三磷酸侧链与碱基母核的连接处引入了烯丙醚的结构，通过增加了醚键和C=C双键来增长了碳链长度。图5显示了衍生物3与RdRp的结合模式，主要结合力有：衍生物3与残基SER814、U20、ASN691、U10、LYS545产生了Conventional Hydrogen Bond作用；母核上的N原子与ALA688间产生Carbon Hydrogen Bond作用；三磷酸的O原子与RdRp上MG1004、MG1005和MG1006产生多对Metal-Acceptor作用；衍生物的C≡C结构与RdRp上残基VAL557、LYS545和ARG555间产生了π-烷基疏水相互作用。

图5 衍生物3与RdRp结合作用力：A 3D图；B 2D图

结合2D图可以看出，与Tri-islatravir相比，Carbon Hydrogen Bond和Metal-Acceptor作用数量相似，烯丙醚的引入实际上增加了侧链的长度，在空间上拉近了磷酸结构上O原子与残基U20的距离，新形成了两个氢键；另外由于空间构象的改变，增加了C≡C结构和残基的π-烷基疏水作用数目。由于氢键作用的主导性和新增的疏水作用，衍生物3对接得分高于Tri-islatravir。

在药物小分子中引入烯丙醚键后，醚类化合物分子中氧原子的孤电子对能与水形成氢键，有一定亲水性，而与醚相连的烯丙基则有亲脂性，使化合物易于通过生物膜，有利于药物的转运，从而提升药物活性，增加类似的双亲基团是一个较好的药效团改造思路。

2.2.2 Ⅱ类配体衍生物

Ⅱ类衍生改造中，得分最高的是衍生物12。如图6所示，衍生物12与RdRp之间的结合力有：与残基SER814、GlU811、U20、ASN691、SER759之 间 产生了Conventional Hydrogen Bond作用；与MG1004、MG1005和MG1006产生了5对Metal-Acceptor作用；与ASP760产生了Carbon Hydrogen Bond作用等。

图6 衍生物12与RdRp结合模式：A 3D图；B 2D图

衍生物12和RdRp的结合模式与Tri-islatravir很相似，主要为氢键和金属受体作用。相对于Triislatravir，六元环上F原子位置发生变化。由于F原子有较强的电负性，使得附近的氮原子上氢的正电性增加，以及空间构象的变化，使得碱基母核上的N与U-20新形成2个氢键，从整体上增加了Tri-islatravir与RdRp的结合能力。

在小分子药物的化学修饰中，往往采用引入卤素的修饰策略以提高小分子药物的亲脂性，氟原子的引入广泛应用于药物的设计和修饰之中，药物设计中的氟取代策略也已经成为药物结构中的重要研究策略之一。氟原子可以改变药物的酸碱性和亲脂性，改善药物的作用时间，减少药物半衰期，而且能够提高配体-蛋白的亲和力，增强药效等。Islatravir腺嘌呤基环上的2-氟（2-F）使它对腺苷脱氨基的氧化具有显著的耐受性。

2.2.3 Ⅲ类配体衍生物

在Ⅲ类配体衍生物中，衍生物20对接得分最高。衍生物20 在芳香碱基母核上引入苯环，它与RdRp的结合模式如图7所示，主要作用力有：与残基 SER814、ASP618、U20、A19、LYS545产 生 了Conventional Hydrogen Bond作 用； 与MMG1004、MG1005和MG1006之间产生了Metal-Acceptor作用；F原子与U20产生了Halogen（氟）作用；衍生物的新增苯环与U-18残基中带负电荷的原子产生了Pi-Anion作用，与ALA-547产生Pi-Alkyl疏水作用。

图7 衍生物20与RdRp的结合模式

观察发现，与Tri-islatravir相比，引入苯环后，衍生物分子尾端的空间构象发生变化，导致碱基母核上与RdRp的结合区域发生了偏移，与RdRp的作用残基和作用力随之改变。结合氢键供受体示意图（图8），衍生物20与RdRp形成氢键和卤素作用的残基由U20、ASN691、ALA688、SER759和 THR687变 为SER814、ASP618、U20、A19和LYS545。此外，由于末端苯基官能团的引入，衍生物20的碱基母核与RdRp产生了完全不同于Tri-islatravir的结合力，新增了Pi-Anion和Pi-Alkyl两种Pi共轭作用。在药物设计中引入苯基，可与分子结构中不饱和键形成稳定的共轭体系，存在诱导效应和共轭效应，有利于发挥药效和维持化合物稳定性。

图8 衍生物20与RdRp结合的氢键供受体示意图

综合三种衍生物的结合力可以看出，为了提高Tri-islatravir类配体与RdRp的结合力，对Triislatravir配体的改造可以采取两种策略：①在不影响Tri-islatravir空间构象的基础上增加氢键数，例如可增加氢键供受体原子或改变供受体原子位置；②氢键数目稳定的前提下，增加与RdRp上残基、原子间的作用力类别和数目，例如通过取代官能团或改变空间构象的方式，来增强与RdRp的疏水作用、静电作用、共轭作用等其他多种作用形式。

3 结束语

新型冠状病毒具有传染性强、变异快、不易失活的特点，目前急需筛选和研发药物进行治疗。通过计算机辅助药物设计进行虚拟筛选，可有效加速新药研发。

Islatravir是一种新型药物，具有独特的抗病毒活性和良好的应用前景。本文基于其活性代谢分子Triislatravir，构建Tri-islatravir衍生物配体分子库。以SARS-CoV-2的RdRp为靶标受体，通过D3Targets-2019-nCoV 平台D3Docking功能，进行分子对接运算，分析Islatravir衍生物配体与RdRp的结合模式，筛选出具有潜在RdRp抑制活性的Tri-islatravir衍生物和活性结构。本文为抗SARS-CoV-2活性成分筛选和研究提供了参考，为后续对潜在活性分子的化学合成提供了研究依据。