miR-133a靶向MMP-14抑制骨肉瘤细胞侵袭的作用及机制研究

黄生祥，梅海波，刘昆，唐进，伍江雁

(湖南省儿童医院小儿骨科，湖南 长沙 410008)

骨肉瘤是好发于儿童和青少年的原发性骨恶性肿瘤，恶性程度较高，肿瘤细胞具有较强的侵袭能力，容易早期发生远处转移[1]。目前，临床上治疗骨肉瘤的主要手段是手术切除联合化疗，虽然患者的5年生存率有所提高，但化疗耐药发生率高、肿瘤复发及转移风险大，整体预后情况仍不理想。目前，骨肉瘤的发病机制未完全阐明，临床上也缺乏有效的靶向治疗手段，因此探究骨肉瘤的发病机制、发现骨肉瘤新的治疗靶点是相关领域的研究热点。

微小RNA(microRNAs，miR)是一类在转录后水平发挥基因表达调控作用的非编码小分子RNA，通过调控原癌基因或抑癌基因的表达参与多种恶性肿瘤的发生发展。miR-133a是一种具有抑癌活性的miR，在骨肉瘤[2]、肺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等多种恶性肿瘤中均呈低表达趋势。Wang等[6]研究证实miR-133a靶向抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-14的表达并抑制肺癌细胞的侵袭。MMP-14在骨肉瘤的侵袭中发挥重要作用，但目前miR-133a在骨肉瘤中调控作用尚缺乏直接证据，miR-133a是否在骨肉瘤的发病中靶向调控MMP-14也不清楚。因此，本实验将以骨肉瘤细胞株为实验对象，分析miR-133a在骨肉瘤细胞中表达的变化并分析miR-133a靶向MMP-14抑制骨肉瘤细胞侵袭的作用。

1 资料与方法

1.1 细胞 正常成骨细胞株hFOB1.19及骨肉瘤细胞株MG63、U2OS、SAOS2均购自ATCC公司，液氮中保存。

1.2 试剂 miR-133a mimic及阴性对照(negative control，NC)mimic购自上海吉玛公司，pcDNA3.1质粒及过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒购自上海生工公司，转染试剂Lipofectamine3000购自Thermo公司，miRNA提取分离试剂盒、miRNAcDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒购自北京天根公司，结晶紫购自Sigma公司，含有MMP-14野生型3’UTR的双荧光素酶报告基因、含有MMP-14突变型3’UTR的双荧光素酶报告基因、双荧光素酶报告基因检测系统均购自Promega公司，ripa裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司，MMP-14一抗购自Abcam公司。

1.3 仪器 细胞培养箱、高速离心机购自上海一恒仪器公司，显微镜购自日本Nikon公司，电泳系统及凝胶成像系统购自上海天能仪器公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 正常成骨细胞株hFOB1.19及骨肉瘤细胞株MG63、U2OS、SAOS2均在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，待细胞密度达到80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶进行消化，按照1︰3的比例传代继续培养。

1.4.2 细胞分组 消化后传代的MG63细胞进行分组，根据不同检测目的接种在不同规格的培养板中，按照下列方法分组干预。(1)miR-NC组：转染NC mimic；(2)miR-133a组：转染miR-133a mimic；(3)pcDNA3.1组：转染pcDNA3.1质粒；(4)pcDNA3.1-MMP-14组：转染过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒；(5)pcDNA3.1+miR-NC组：同时转染pcDNA3.1质粒及NC mimic；(6)pcDNA3.1+miR-133a组：同时转染pcDNA3.1质粒及miR-133a mimic；(7)pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a组：同时转染过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒及miR-133a mimic。

1.4.3 miR-133a表达的荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测 MG63细胞接种在12孔培养板中，按照1.4.2的方法转染24 h后，弃去培养基，用miRNA提取试剂盒提取细胞中的miR，用miRcDNA第一链合成试剂盒将miR反转录为cDNA，用miR荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系后在荧光定量PCR仪中进行PCR反应，反应程序设置为95℃预变性3 min后重复95℃ 15 s及60℃ 34 s的循环40次，反应完成后生成循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参、按照公式2-ΔΔCt计算miR-133a的表达水平。

1.4.4 细胞侵袭的Transwell检测 在Transwell上室内加入基质胶，将MG63细胞接种在Transwell上室内，在下室内加入500 μL含有10%胎牛血清的培养基，按照1.4.2的方法转染24 h后，取出上室并在磷酸盐缓冲液中漂洗3遍，而后用棉签擦去上室内未侵袭的细胞，用4%多聚甲醛固定后用结晶紫染色，在显微镜下随机观察3个高倍视野，并对侵袭细胞进行计数。

1.4.5 MMP-14表达的western blot检测 MG63细胞接种在12孔培养板中，按照1.4.2的方法转染24 h后，弃去培养基，用ripa裂解液提取细胞中的蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白含量，取含有30 μg蛋白的样本与上样缓冲液混合后加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，电泳分离蛋白后电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中、室温封闭1 h，而后将PVDF膜放入1︰1 000稀释的MMP-14一抗或1︰5 000稀释的β-actin一抗中、4℃孵育过夜，再将PVDF膜放入1︰2 000稀释的二抗中、室温孵育1 h，最后加入电化学发光(electro-chemi luminescence，ECL)显影液并在凝胶成像仪中曝光，根据蛋白条带的灰度值计算MMP-14的表达水平。

1.4.6 双荧光素酶报告基因实验 MG63细胞接种在24孔培养板中，将双荧光素酶报告基因与NC mimic或miR-133a mimic共同转染进入细胞，24 h后弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗2遍后，用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞中萤火虫荧光活力及海肾荧光活力，按照公式(萤火虫荧光活力/海肾荧光活力)计算双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力。

2 结 果

2.1 骨肉瘤细胞株中miR-133a表达的变化 hFOB1.19、MG63、U2OS、SAOS2细胞中miR-133a的表达水平分别为(0.83±0.22)、(0.41±0.08)、(0.55±0.06)、(0.57±0.06)。不同细胞中miR-133a表达水平比较，差异有统计学意义(F=6.172，P=0.001)。与正常成骨细胞株hFOB1.19比较，骨肉瘤细胞株MG63、U2OS、SAOS2中miR-133a表达均明显降低(t值分别为4.012、2.746、2.550，P值分别为0.004、0.025、0.034)；并且MG63细胞中miR-133a表达降低最为显著。后续将以MG63细胞进行miR-133a生物学功能的验证。

2.2 过表达miR-133a对细胞侵袭的调节作用 与miR-NC组比较，miR-133a组细胞中miR-133a的表达水平明显增加(t=9.099、P<0.001，见图1a)，细胞侵袭数目明显减少(t=4.420、P=0.002，见图1b～c)。

a miR-133a表达的比较 b 侵袭细胞的结晶紫染色(结晶紫染色，×400) c 细胞侵袭数目的比较

2.3 过表达miR-133a对细胞中MMP-14表达的调节作用 与miR-NC组比较，miR-133a组细胞中MMP-14的表达水平明显减少(t=4.588、P=0.002，见图2a)；经Targetscan分析，miR-133a靶向结合MMP-14基因mRNA 3’UTR(见图2b)；经双荧光素酶报告基因验证，与miR-NC组比较，miR-133a组野生型双荧光素酶报告基因的荧光活力明显降低(t=5.194、P=0.001，见图2c)，突变型双荧光素酶报告基因的荧光活力无明显变化(t=1.828、P=0105，见图2d)。

a MMP-14表达的比较

2.4 过表达MMP-14对miR-133抑制细胞侵袭作用的影响 与pcDNA3.1+miR-NC组比较，pcDNA3.1+miR-133a组细胞中MMP-14的表达水平明显减少(t=7.726，P<0.001)；与pcDNA3.1+miR-133a组比较，pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a组细胞中MMP-14的表达水平明显增加(t=7.752、P<0.001，见图3a)。

与pcDNA3.1+miR-NC组比较，pcDNA3.1+miR-133a组的细胞侵袭数目明显减少(t=5.824、P<0.001)；与pcDNA3.1+miR-133a组比较，pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a组的细胞侵袭数目明显增加(t=4.911、P=0.001，图3b～c)。

a MMP-14表达的比较

3 讨 论

骨肉瘤的发病涉及多基因、多步骤、多因素，但具体的分子机制尚未阐明。骨肉瘤恶性程度高、容易早期发生远处转移，而骨肉瘤细胞极强的侵袭能力是造成骨肉瘤远处转移的关键生物学行为，因此研究骨肉瘤细胞侵袭的调控机制有助于深入认识骨肉瘤的发病机制。

近些年，miR在骨肉瘤侵袭中的调控作用受到了越来越多的关注，miR-96、miR-181a、miR-320a等多种miR均被证实能够促进或抑制骨肉瘤细胞的侵袭[7-9]。miR-133a是一种具有抑癌作用的miR，在骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均呈低表达趋势[2，10-12]。本实验检测了3种骨肉瘤细胞株中miR-133a的表达水平，与正常成骨细胞株hFOB1.19比较，骨肉瘤细胞株中miR-133a的表达水平均明显降低。与既往其他研究在骨肉瘤临床样本中发现的miR-133a低表达结果一致，提示miR-133a低表达可能参与骨肉瘤的发生发展，但目前仍缺乏miR-133a调控骨肉瘤细胞侵袭的相关研究报道。本实验还发现，在3种骨肉瘤细胞株中MG63细胞中miR-133a表达降低最显著，因此后续将在此细胞株中研究miR-133a对侵袭的调控作用。

在MG63细胞中，通过转染miR-133a mimic的方式增加miR-133a的表达后，MG63细胞的侵袭数目明显减少，表明miR-133a对骨肉瘤细胞的侵袭具有抑制作用。miR-133a与其他miRs相似，并不直接发挥调控生物学行为的作用，而是通过结合靶基因mRNA 3’UTR的方式来抑制基因表达，进而调控细胞的生物学行为。肺癌的相关研究表明，miR-133a抑制细胞侵袭的作用与靶向抑制MMP-14的表达有关[6]；本实验在Targetscan中进行生物信息学分析也证实，MMP-14基因mRNA 3’UTR中有miR-133a的结合位点。在此基础上，本实验观察了miR-133a对骨肉瘤细胞中MMP-14表达的靶向调节作用，在转染miR-133a mimic后，细胞中MMP-14的表达水平明显降低，含有MMP-14野生型3’UTR的双荧光素酶报告基因的荧光活力也降低。根据Targetscan生物信息学预测结果将MMP-14的3’UTR进行突变后，miR-133a不影响双荧光素酶报告基因的荧光活力。以上结果表明miR-133a能够靶向结合MMP-14基因mRNA的3’UTR并抑制基因表达，并且其靶向结合位点与Targetscan的预测一致。

MMP-14是MMPs家族中介导细胞外基质及细胞基底膜水解的重要成员之一，对胃癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤细胞的侵袭具有促进作用[13-15]。Ho[16]和Wu[17]的研究也证实MMP-14在骨肉瘤中表达上调。本实验在观察到miR-133a抑制MG63细胞侵袭及细胞中MMP-14表达后，进一步验证了MMP-14在miR-133a抑制MG63细胞侵袭中的作用。在转染miR-133a mimic的同时，将过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒也转染进入MG63细胞，通过转染质粒的方式过表达MMP-14后观察到：miR-133a抑制MG63细胞侵袭的作用明显减弱，表明miR-133a抑制MG63细胞侵袭的作用与其靶向抑制MMP-14的表达有关，因为过表达MMP-14能够削弱miR-133a抑制MG63细胞侵袭的作用。

综上所述，miR-133a在骨肉瘤细胞中表达下调，过表达miR-133a能够抑制骨肉瘤MG63细胞侵袭、抑制MMP-14表达，靶向MMP-14基因mRNA 3’UTR是相关的分子机制，未来miR-133a可能成为阐明骨肉瘤发病机制的新靶点。