软枣猕猴桃多糖提取以及生物活性的研究进展

丁心悦，时东方，辛树权，李福森，倪秀珍

(长春师范大学，吉林 长春 130032)

软枣猕猴桃(Actinidiaarguta(Sieb.et Zucc) Planch.ex Miq.)为猕猴桃科、猕猴桃属多年生落叶藤本植物，也叫“软枣子”“奇异莓”[1]。鲜果可食用，营养价值高，除富含维生素C外，还含有黄酮、多糖、生物碱、皂苷等多种活性成分[2-3]。猕猴桃属植物是天然植物多糖的丰富来源，其中软枣猕猴桃的多糖含量较高，是中华猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)的4倍[4]。研究表明，软枣猕猴桃具有明显的免疫调节、抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌消炎等作用，其药理作用与其中所含的黄酮类、多糖等成分密切相关[5-7]。

多糖在食品、医药、科研、生物可降解包装材料等新产品的开发中发挥着重要作用，开发用于功能食品或制药的植物多糖已成为近年来的研究重点[8]。多糖以糖复合物广泛存在于自然界中，依照其主要来源分为真菌多糖、动物多糖和植物多糖三大类[9]。植物多糖存在于所有植物中，是植物中的一种能量储存形式，作为能量供应者和支持植物的结构物质。它们在植物的根、茎、叶、种子和果实中含量丰富，例如淀粉、纤维素、果胶和其他功能性多糖等[10]。植物多糖提取相对简单，天然植物来源的植物多糖因对正常的细胞无毒副作用且具有抗炎、保湿等功效，被广泛应用于制药、食品、保健品、化妆品等领域[11]。多糖是许多临床药物中的重要活性成分，由于具有保护细胞膜、清除自由基和抗衰老等强大的抗氧化特性，是生物医学研究领域的热点。本文阐述了近年来软枣猕猴桃多糖的提取、结构以及生物活性等方面的研究进展，以期为软枣猕猴桃多糖在功能性食品以及药物等领域的开发利用提供理论依据。

1 软枣猕猴桃多糖提取方法

一些多糖可以直接从谷类、薯类等植物中获得。然而，大多数非淀粉多糖需要用水，温和碱或酸溶液提取[12]，也可利用加热，微波和超声处理等辅助方法用于提高多糖的提取效率[13]，再通过透析、乙醇沉淀、盐沉淀或直接冷冻干燥从水溶液中回收多糖。软枣猕猴桃常用的多糖提取方法有：水提醇沉法、微波提取法和超声波提取法等。

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最传统和最常用的方法，多糖是高极性的多羟基化合物[14]，因此，以高极性蒸馏水为溶剂提取植物多糖是常用的方法。在使用水提醇沉法提取多糖时应计算好料液比、提取的时间、提取的次数以及温度等。杜凡星等[15]利用料液比1∶15 g·mL-1，70℃水浴，过滤，旋转蒸发，加入一定量无水乙醇来提取多糖，5 000 r·min-1离心20 min，干燥，称重，稀释至100 mL，用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。得出水浴醇沉时间为4 h时，多糖提取率为9.29%，无水乙醇用量为样品体积的4倍。李昕昕等[16]研究软枣猕猴桃多糖的提取时发现，软枣猕猴桃多糖的最佳提取工艺参数为料液比1∶25，提取温度90℃，提取时间3 h，提取溶液pH值为6.5～7.0。此条件下软枣猕猴桃粗多糖得率为45.62%。但该技术既耗时又费力，而且易降解多糖的结构并导致多糖活性降低。

1.2 微波提取法

微波提取，又称微波萃取，利用高频电磁波穿透细胞，从而破坏细胞使细胞内物质迅速释放出来，微波提取同超声波提取一样能在低温下快速而高效地提取多糖[17]。微波辅助萃取与常规方法相比，具有缩短提取时间、节省提取溶剂以及提高多糖提取率等优点[18]。杜凡星等[15]按料液比1∶30 g·mL-1加入蒸馏水，将样品放入微波炉中，微波功率400 W，微波时间15 min加热，过滤，旋转蒸发，用一定量无水乙醇萃取，5 000 r·min-1离心20 min，干燥、称重、定容至 100 mL。多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，提取率为4.35%。 常清泉等[19]在微波时间40 min，微波输出功率315 W，料液比为59 g·mL-1的条件下，从长白山产软枣猕猴桃茎中提取多糖，多糖提取率为2.85%。彭雪等[20]利用微波法提取软枣猕猴桃干粉中多糖的研究结果表明，最优的提取工艺为：提取功率300 W，提取时间120 s,料液比1∶27 g·mL-1。然而，该技术在实际操作中需要更高的测试设备，并且难以用于大规模生产[21]。

1.3 超声波提取法

超声波辅助提取是利用超声波的机械效应、空化效应和热效应，缩短提取时间，降低提取温度等[22-24]，使物料中的有效成分快速溶解的提取方法。超声辅助萃取在不改变聚合物化学结构的情况下是有效的，与常规方法相比具有缩短提取时间、降低提取温度以及提高多糖提取率等优点[23-25]。王美月等[26]采用正交试验利用超声提取工艺对软枣猕猴桃的多糖进行提取，得出料液比1∶15 g·mL-1，超声温度50℃，超声时间50 min，超声功率90 W时为最佳提取工艺，利用此方法得出多糖的提取率为2.05%。常清泉等[19]对长白山产软枣猕猴桃叶多糖超声提取工艺为超声时间40 min，料液比为40 g·mL-1，超声提取功率为900 W，在此条件下叶多糖得率为 4.50%。纪旭光[27]利用超声工艺对软枣猕猴桃果实提取多糖的条件是超声时间70 min，超声功率350 W，料液比为1∶35 g·mL-1，但该方法的产热效应不强[28-30]。

2 软枣猕猴桃多糖的分离纯化方法

多糖经早期提取后，除去杂质、色素、小分子等物质，得到粗多糖，而这些粗多糖实际上是许多分子量和结构不同的多糖的混合物。常用的多糖分离纯化方法包括有机溶剂除杂法、除蛋白法以及离子交换法等。

2.1 有机溶剂除杂法

因多糖难溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮反复沉淀、洗涤，除去醇溶物。宣丽[31]采用正交试验优化乙醇除杂工艺，最终得出乙醇浓度80%，料液比1∶2 g·mL-1，温度20℃，时间60 min为最优条件。在此条件下，样品中还原糖的提取率可达到8.00%，而多糖的损失率仅为0.04%，在几乎不损失多糖的前提下最大程度除去色素、还原糖等杂质。薛刚等[32]利用有机溶剂除杂工艺对野生猕猴桃的多糖进行纯化得到含量为13.35%的多糖产品。牛强[33]利用三氯乙酸法对软枣猕猴桃枝条多糖进行除杂处理，研究表明，三氯乙酸浓度10%时为除杂的最佳浓度。

2.2 除蛋白法

由于蛋白质与多糖相似，同属于强极性生物大分子，故多糖提取液中普遍含有蛋白质，而去除蛋白干扰是多糖精制的重中之重。Savage 法作为经典去蛋白法，因其条件温和，处理后多糖的连接键不易断裂，多糖性质不变而被广泛应用，不足之处就是需多次重复才可去尽蛋白，耗时长且多糖样品易损失。目前，多数研究旨在找出既能提高蛋白的脱除率，又能保证多糖损失小的办法。刘长江等[34]利用 Savage 法对粗多糖进行脱蛋白后用DEAE-sephadex A-50、Sephadex G-75 和 Sephadex G-100 凝胶柱纯化，得到单一组分后将原料冻干就可得到纯软枣猕猴桃多糖。刘长江等[35]利用8种树脂对软枣猕猴桃多糖水溶液进行脱蛋白试验研究，得出在利用静态吸附工艺条件下，NKA-9树脂脱蛋白率达到了87.2%。

2.3 离子交换法

离子交换法是最常用的脱色法，通过离子交换柱色谱不仅可以脱色，而且可以根据多糖的离子强度不同对其进行分离[36]。杜凡星等[15]使用DEAE-52纤维素阴离子交换柱色谱分离纯化软枣猕猴桃中的粗多糖。用蒸馏水和0.1、0.2、0.3 mol·L-1NaCl洗脱后的得率分别为16.1%、7.2%、4.5%和2.3%。刘长江等[2]的研究表明，软枣猕猴桃粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换色谱法预分离后得到软枣猕猴桃四种多糖组分，经凝胶柱层析进一步分离，就可以完成软枣猕猴桃多糖的纯化。吴瑾瑾等[37]利用阴离子树脂交换法对猕猴桃根多糖进行纯化，其纯度可达到85%以上。

3 软枣猕猴桃多糖生物活性研究

由于抗生素的耐药性增加以及合成抗氧化剂的毒性增强，人们越来越关注天然生物活性化合物的开发利用。许多研究表明，植物多糖在免疫调节[38-39]、抗病毒[40-41]、抗癌[42]、抗凝血[43]、降脂降血糖[44-45]、抗氧化[46]等方面发挥着重要作用。同样，对软枣猕猴桃多糖活性的实验研究表明，其具有抗氧化、抗菌消炎、降脂降血糖、调节免疫等作用。

3.1 抗氧化活性

软枣猕猴桃多糖具有抗氧化活性的作用。活性氧(ROS)如羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-)在氧化代谢过程中不断产生被认为是人类衰老的重要原因[47-48]。源自生物体的ROS过度积累可导致氧化应激，氧化应激被认为是免疫损伤、风湿性关节炎和动脉粥样硬化等各种疾病的主要发病机制[49]。然而，越来越多的证据表明，合成抗氧化剂可导致肝损伤和致癌，而天然抗氧化化合物可以保护生物体免受侵害并延缓多种慢性疾病的发作，这引起了人们广泛关注。DPPH自由基清除试验是用于研究化合物抗氧化活性的最常用方法。WANG等[50]研究表明软枣猕猴桃活性成分在DPPH上表现出强烈且与浓度相关的清除活性；刘旸旸[51]对软枣猕猴桃生物碱体外抗氧化活性进行了研究,实验结果表明,与Vc相比,软枣猕猴桃生物碱清除DPPH自由基能力和抗脂质体过氧化能力好于Vc。软枣猕猴桃生物碱对超氧阴离子自由基和羟基自由基有一定的清除作用,但明显差于Vc。软枣猕猴桃生物碱对Fe3+具有较好的还原作用,但还原能力稍差于Vc；刘长江等[2]通过研究软枣猕猴桃清除自由基的能力来评估猕猴桃多糖的抗氧化活性。软枣猕猴桃多糖具有很强的去除DPPH自由基和·R的能力，IC50值分别为0.497和0.547 mg·mL-1。在受试范围内，软枣猕猴桃的去除能力随着多糖浓度的增加而增加，DPPH自由基和·R的最终去除率与VC相近。且软枣猕猴桃多糖具有特定的去除·OH的能力，IC50值为 0.668 mg·mL-1。随着多糖质量浓度的增加，它们的去除能力增加，但是与VC相比，·OH 的去除率存在一定的差距。软枣猕猴桃多糖对O2-的去除率低，去除能力弱。由此可见，软枣猕猴桃的多糖具有很强的抗氧化作用。

3.2 抗菌消炎

软枣猕猴桃多糖具有抗菌消炎的作用。KIM等[52]以软枣猕猴桃茎的提取物为研究对象，探究了对未加工细胞中脂多糖诱发的炎症影响，实验结果表明，软枣猕猴桃茎的提取物通过抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化以及nf-kB的核转运进而发挥抗炎作用；WANG等[50]研究了软枣猕猴桃对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌以及真菌生物的体外抗菌活性，结果表明，软枣猕猴桃对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有显著的抗菌活性，但对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的抗菌活性不明显。郑煜焱等[53]研究表明，野生软枣猕猴桃多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌等有抑制作用,并且随着软枣猕猴桃多糖浓度的增加，抑菌作用增强，最低抑菌浓度为10～25 mg·mL-1，对热带假丝酵母菌无抑菌作用。温度和pH值对野生软枣猕猴桃多糖的抑菌效果也有一定影响，温度越高，抑菌效果越明显，并且偏酸性的环境更有利于抑菌，pH在4～5范围内，野生软枣猕猴桃多糖抑菌效果较好。

3.3 降血糖血脂

软枣猕猴桃多糖具有降血糖血脂的作用，研究表明与软枣猕猴桃降血糖作用相关的主要活性成分是多酚和多糖类化合物[54]。刘延吉等[55]研究表明，软枣猕猴桃多糖显著降低糖尿病模型小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯，显著升高高密度脂蛋白，从而使体内血脂水平趋于正常水平，能够防止糖尿病导致的脂类代谢紊乱，并对糖尿病的并发症有防治作用。软枣猕猴桃多糖能有效降低糖尿病小鼠血糖和血脂，提高糖尿病小鼠的糖耐量和肝糖原含量。软枣猕猴桃多糖可能对胰岛β细胞有一定的修复作用，为研究新的降血糖剂型和获得新的纯天然功能性食品提供了具体的理论依据。陈罡等[56]通过研究软枣猕猴桃多糖对高脂食小鼠脂代谢的影响发现，软枣猕猴桃多糖能显著降低小鼠血清和肝脏中总胆固醇和甘油三酯的含量，提高肝脏中高密度脂蛋白胆固醇水平。肝脏组织病理观察结果表明，软枣猕猴桃多糖能够明显改善并缓解肝脏脂肪高血脂症状。小鼠粪便脂质水平测定结果表明，软枣猕猴桃多糖能显著提高高脂小鼠粪便中的总脂、胆固醇和甘油三酯含量，说明软枣猕猴桃多糖能够起到降低胆固醇水平的作用是通过促进胆固醇排泄途径来实现的。

3.4 免疫调节

软枣猕猴桃多糖具有免疫调节的作用。脾脏作为人体最主要的免疫器官，含有大量的免疫 T 细胞和 B 细胞，能产生与免疫调节有关的活性物质，是研究免疫系统的一个极其重要的组织[57-58]，脾脏指数能够反映免疫程度的高低。侯芳玉等[59]研究表明，软枣猕猴桃茎多糖(AASP)对小鼠免疫功能有显著促进作用，是一种有效的免疫调节剂。软枣猕猴桃茎多糖在体内和体外均能增加ConA和LPS对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖作用，其中多糖含量100 mg·kg-1时作用最为显著，在体外AASP具有促进有丝分裂的作用。AASP还促进小鼠淋巴因子的产生，因此，AASP可能在抗肿瘤免疫中发挥特定作用。此外，AASP可以促进B细胞对SRBC抗体的初级反应，增强巨噬细胞的吞噬能力。刘怡菲[60]研究软枣猕猴桃多糖对小鼠免疫系统的影响，其结果表明，软枣猕猴桃多糖对小鼠进行灌胃处理时对小鼠外周血总T细胞、辅助T细胞比例有短暂的促进作用，对小鼠外周血中B细胞和毒性T细胞比例有抑制作用，对小鼠外周血中NK细胞的比例有一个延迟且瞬时的促进效应。宣丽[31]通过体内实验研究了软枣猕猴桃多糖AAP-3经过DEAE-52纤维素柱层析后用0.1 mol·L-1洗脱后得到的组分即AAP-3b的免疫活性，结果表明，软枣猕猴桃多糖AAP-3b高剂量组可以促进大鼠的生长，并显著提高大鼠的脾脏指数; AAP-3b中剂量组和高剂量组可以显著提高大鼠的胸腺指数、吞噬指数和ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞转化指数。确证了软枣猕猴桃多糖可以通过促进免疫器官生长、增强细胞免疫功能、增强单核巨噬细胞吞噬能力等方式来提高机体的免疫力，具有一定的免疫活性。

3.5 抗肿瘤、抗糖化等作用

软枣猕猴桃多糖具有抗肿瘤、抗糖化以及防止紫外线照射的作用。利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察A459细胞的DNA损伤，经过48 h或72 h后A549细胞表现出典型的凋亡特征。细胞核和细胞质中存在致密的黄绿色染色形成细胞膜囊泡，裂解的细胞核以及凋亡体。故证实了软枣猕猴桃中的活性成分诱导A549肿瘤细胞凋亡的能力，从而具有抗肿瘤活性。侯芳玉等[61]研究表明软枣猕猴桃茎多糖可显著提高鼠伤寒杆菌感染的小鼠生存率，抑制小鼠实体瘤的增殖，其机理可能与能增强机体的免疫功能有关。

软枣猕猴桃多糖对蛋白质羰基的产生和荧光糖基化中期产物的形成有抑制作用。ZHU等[62]对软枣猕猴桃多糖进行了体外抗糖化研究，实验结果表明，软枣猕猴桃多糖对糖基化早期产物、糖基化中期产物、糖基化终期产物都有抑制作用，对丙酮醛没有清除能力。

李昕昕等[63]研究表明，软枣猕猴桃的多糖含量与能够承受紫外线照射的酵母菌数量成正比，由此说明软枣猕猴桃多糖能够帮助酵母菌阻挡紫外线的照射。

4 讨论与展望

不同的提取方式不仅使多糖提取率不同，也会对多糖的组成、结构以及理化性质产生一定的影响。提取方法的选择取决于实验材料的特性，不同提取方式各有优劣，在实际操作中可根据实际情况将不同方法有机结合以达到高效高产并且杂质含量低的目的。

对于软枣猕猴桃多糖的提取、分离纯化，研究人员进行了相关的实验研究，但从软枣猕猴桃内提取纯化出的多糖种类还较少。通过查阅文献发现，软枣猕猴桃多糖具有一定的抗氧化、抗菌消炎、降脂降血糖、免疫调节等作用，未来软枣猕猴桃多糖可作为一种新型的天然抗氧化剂、新型药物或功能性食品来使用。