云耳百云6号菌丝液体深层培养物发酵酒的研制

李发盛，黄劭兰，黄雪星，欧娜，周兴，何达崇

1. 广西科学院生物研究所（南宁 530003）；2. 南宁市文华学校（南宁 530007）；3. 广西科学院（南宁 530003）

食药用真菌通过工业深层发酵方法生产其菌丝体及代谢产物都可以在短期内得到，利用这些发酵产物可以开发出新型营养饮料和营养保健食品，制备药品保健美容化妆品、生产饲料蛋白等[1-2]。

发酵酒是指发酵后不需要经过一系列的化学反应，酿造的产物直接作为产品来饮用的酒类，其酒精度数偏低，多数用果类、粗粮类、乳制品类等为发酵材料，添加所需的酵母后直接发酵而成。随着人们生活水平不断提高，保健意识增强，酒类消费更加趋向于低酒精度、高保健效果的酿造酒，因此，兼具营养保健型的低酒精饮品具有很大发展空间[3]。

研究发现，与固体培养的子实体相比较，液体培养的菌丝体营养物质成分类似，且深层发酵具有低成本、高产量、生长周期短的优势[3]。利用液体深层发酵培养的食药用菌菌丝体进行发酵酒的研制也有文献报道[4-9]，但使用液体深层发酵全培养物（含菌丝体及全部培养液）进行发酵酒的研制未见报道。

黑木耳（Auricularia auricular）是一种药食同源的大型真菌，富含多种生物活性物质，包括可溶性糖、蛋白质、脂肪、矿质元素、维生素和粗纤维等营养物质以及黑色素、果胶、总酚和总黄酮等非营养物质，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤等生理活性，可用于防治冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病，还能化解结石，预防宫颈癌、直肠癌及其他消化系统癌症[10-11]。

广西所产黑木耳俗称云耳，同样兼具营养和保健功能，只因产地、生态种的不同，其所含营养物质及各种生物活性物质的种类和数量与其他地域的黑木耳会有区别。云耳百云6号是从野生云耳子实体分离并经驯化获得的生产性能较好的优良菌株，其子实体嫩脆爽滑香，是迄今为止广西区内食药用菌类获得国家新品种认证的唯一一个本土种质资源，也填补了广西食药用菌栽培无本土种的空白。以云耳百云6号菌丝体深层发酵全液为原料，添加适量葡萄糖，经过胶体磨破碎均质后，加入酒精酵母发酵，稍调配可获得一款口感好、富含营养和生物活性物质的低酒精度饮品，为云耳深加工拓宽新途径，也为其他食药用菌的精深加工提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

百云6号，系经过自然选育获得的广西本土优良云耳菌株，并已通过国家新品种认定，本所保藏。

Q303，糖化型根霉，从贵州轻工研究所引进，本所保藏。

1308，酒精酵母，华中农业大学提供，本所保藏。

1.2 供试培养基、试剂和仪器

百云6号斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，VB10.01 g，琼脂粉15 g，自来水1 000 mL，pH自然。

百云6号菌丝体优化液体培养基：马铃薯（去皮）10%；麸皮3%；葡萄糖2%；红糖1.5%；蛋白胨0.3%；酵母粉0.15%；磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3%；硫酸镁（MgSO4）0.15%；维生素B1（VB1）1 mg/100 mL；微盐1 mL/100 mL；pH 6.5；花生油6滴/ 100 mL。

1308斜面及液体培养基：12%甜酒汁，pH 6.0，斜面培养基加0.5%琼脂粉。

主要试剂：试验所涉及的药品均为分析纯。

主要仪器与设备：电子分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；生化培养箱（广东省医疗器械厂）；恒温振荡培养箱（常州丹瑞实验仪器设备有限公司）；胶体磨（廊坊市朗通机械有限公司）；手持糖量计（昆山宏达光学仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

图1 发酵酒工艺流程

1.3.2 培养基制备

PDA斜面培养基：土豆去皮，取200 g切成粒状，加1 000 mL水，煮沸30 min，用4层纱布过滤，滤液中加入其他组分，溶解后，定量至1 000 mL，调pH至6.0～6.5，用18 mm×180 mm试管分装，加塞，于0.11 MPa灭菌30 min，趁热摆斜面。

液体发酵培养基：麸皮筛去细粉，取30 g粗皮，加20倍水，于80±2 ℃水浴浸提约4 h；土豆去皮，取100 g切成粒状，加400 mL水，于80±2 ℃水浴浸提约4 h。两者用4层纱布过滤，滤液混合，加入其他组分，溶解后，定量至1 000 mL，调pH至6.0～6.5，用500 mL三角瓶分装，150 mL/瓶，加盖8层纱布及牛皮纸，于0.11 MPa灭菌30 min。

甜酒汁培养基：糯米加水浸泡10～12 h，沥干水分，隔水蒸至熟透，趁热打散冷却至32 ℃左右，加入0.5%的麸皮和培养成熟的Q303根霉种，拌匀，倒入洁净的容器内，厚度5～8 cm，中间打窝，加盖，置于32 ℃恒温培养箱培养32 h左右。加入3倍糯米量的60 ℃水，打散团块，恒温水浴锅60 ℃糖化4 h，纱布抓滤得粗滤液，加入鸡蛋清边搅拌边加热至沸腾，用粗滤纸过滤得到清澈透明的甜酒汁，调整糖度13%、pH 6，分装三角瓶，或加入0.5%琼脂粉，按常规做成斜面培养基，于0.11 MPa灭菌30 min。

1.3.3 菌种培养

百云6号斜面种子培养：严格按照无菌操作要求，取1 mm2左右种块转接到新鲜的PDA斜面，于26 ℃培养10 d左右长满斜面，再次转接到PDA斜面培养基，于26 ℃培养至菌丝体盖满斜面，作为液体发酵种子待用。

酒精酵母1308的扩大培养：严格按照无菌操作要求，用接种环取1环菌落于新鲜的甜酒汁斜面培养基进行划线接种，于28 ℃培养24 h。成熟后转接到新鲜的500 mL三角瓶甜酒汁液体培养基中，于28 ℃静置培养24 h左右待用。

1.3.4 百云6号菌丝液体摇床发酵

严格按照无菌操作要求，在超净工作台内，用接种刀将斜面种子切成1 mm2左右小种块，然后用接种铲移接种块（尽量不带培养基）到液体发酵培养基中，每支斜面种子接3～5个三角瓶。接种完毕，于26 ℃、180 r/min条件下发酵9 d。

1.3.5 酒精发酵

百云6号菌丝体液体发酵结束，将所有三角瓶内的正常培养物合并，按培养物总量的23%加入葡萄糖，经胶体磨破碎均质后，移入10 L玻璃缸内，加入10%的1308液体种子，搅拌均匀后，加盖密封于室温下（30±5 ℃）发酵30 d，过滤即为发酵原酒。

1.3.6 配制

发酵原酒配不同比例纯正蜂蜜进行品评，得出最佳蜂蜜添加量。

1.4 成分检测

委托广西分析测试研究中心对发酵原酒进行成分检测。检测方法如下：

酒精度：GB 5009.225—2016第二法；总糖（以葡萄糖计）、总酸：GB/T 15038—2006；总酯：GB/T 10345—2007中8；碳水化合物：GB 28050—2011；蛋白质：GB 5009.5—2016第一法；总黄酮：SN/T 4592—2016；多糖：《配制白酒中枸杞多糖含量测定方法的研究》[12]；氨基酸：GB 5009.124—2016；色氨酸：GB/T 15400—2018；维生素A、维生素E：GB 5009.82—2016；维生素B1：GB 5009.84—2016；维生素B2：GB/T 5009.85—2016；铁（Fe）、锌（Zn）、钙（Ca）：GB 5009.268—2016第二法；果胶（以半乳糖醛酸计）：NY/T 2016—2011；细菌总数：GB 4789.2—2016；大肠杆菌：GB 4789.3—2016第一法；沙门氏菌：GB 4789.4；金黄色葡萄球菌：GB 4789.10。

2 结果与分析

2.1 百云6号液体摇床发酵

以优化的液体培养基摇床发酵9 d，培养物似浆糊状结束培养，菌球小片段均匀密布整个培养物，菌丝体干重为1.73 g/100 g发酵物。静置3 d未见分层，这与其中高质量浓度多糖和果胶关系密切，其中果胶便具有稳定、胶凝、乳化等特性[13]。

2.2 酒精发酵

合并摇床培养物加糖胶磨后，虽未经消毒处理，但主发酵期72 h内，可明显观察到发酵液处于翻滚状态，液面无任何异常气泡产生，也未闻到任何异常气味，说明酒精发酵非常顺畅。

2.3 百云6号菌丝体发酵原酒分析

2.3.1 感官指标

色泽：黄褐色、均匀一致；状态：鲜亮、透明、有光泽，无杂质、无沉淀；香气：具有菌丝体特有的淡淡清香和典型陈年黄酒气味；滋味：口感醇正、自然，但甜味不足、酸味有些突出；酒体：色香味基本协调，味感稍有寡淡，柔和、醇厚性稍有欠缺。

2.3.2 理化指标

菌丝体发酵原酒各项理化指标的检测结果见表1。云耳百云6号菌丝液体深层培养物发酵原酒（下文称“云耳菌丝发酵原酒”）除含有正常发酵酒具有的酒精、糖、酸、酯外，还含有丰富的蛋白质，达490 mg/100 mL，以及多糖、果胶、黄酮等生物活性物质，其中多糖、果胶质量浓度分别达到123.2和18.2 mg/100 mL；此外，还含有钙、铁、锌矿物质元素及B族维生素。说明，该发酵酒不但营养价值较高，并且具有一定的保健功能。

表1 云耳百云6号菌丝液体深层培养物发酵原酒理化成分分析结果

2.3.3 氨基酸质量浓度

食物蛋白质营养价值的高低，主要取决于所含必需氨基酸的种类、数量及组成比例，云耳菌丝发酵原酒富含人体8种必需氨基酸，且组成比例较好，必需氨基酸种类齐全（表2），其EAA/TAA为32.13%，EAA/NEAA达52.69%，比较接近FAO/WHO标准的36%和60%要求[14]。

表2 云耳百云6号菌丝液体深层培养物发酵原酒氨基酸组成分析结果 单位：mg/100 mL

2.3.4 微生物指标

云耳菌丝发酵原酒中细菌菌落总数5 CFU/mL；大肠菌群＜0.03 MPN/mL，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未检出。检测结果符合食品安全国家标准 GB 2758—2012《发酵酒及其配制酒》中微生物的限量要求。

2.4 配制

基于发酵原酒存在的一些缺点，特以广西本土生产的纯正蜂蜜进行调配和品评，结果如表3所示。云耳菌丝发酵原酒以添加5%的纯正蜂蜜为最佳方案。经配入5%纯正蜂蜜后，不但使酒体更加丰满协调、入口更加绵柔、适口性更好、酒香清香蜜香俱佳，为该发酵酒赋予了更多的营养保健成分，不失为一款优良的发酵酒。

表3 云耳百云6号菌丝液体深层培养物发酵原酒添加纯正蜂蜜后酒体评价结果

3 结论和讨论

以优化的液体培养基进行百云6号菌丝深层发酵，获得浆糊状、均匀一致、不分层、布满菌丝小片段的培养物，经加糖胶磨，添加酒精酵母发酵过滤后，获得酒精度为10.3%vol的发酵原酒，经检测各项指标均符合国家标准。其总糖、总酸、总酯质量浓度分别为146，620和69 mg/100 mL，还含有丰富的营养和生物活性物质，其中碳水化合物、蛋白质、总氨基酸、多糖、果胶质量浓度分别为890，490，305，123.2和18.2 mg/100 mL；酒体黄褐色、澄清透明，有光泽，无沉淀物和悬浮物，具有菌丝特有清香及陈黄酒酒香，无不良杂味，但口感味道稍寡淡。配入5%纯正蜂蜜后，不但使酒体更加丰满协调、入口更加绵柔、适口性更好、酒香清香蜜香俱佳，更为该发酵酒赋予了更多的营养保健成分。研究认为，菌多糖、果胶、黄酮都是具有生理活性的物质[15-17]；蜂蜜的营养成分非常复杂，主要成分是糖类，还有氨基酸、维生素、有机酸、生物酶等，具有保护胃肠道、抑菌消炎、抗氧化、保护心血管等作用[17-18]。

食药用真菌在深层培养过程中会产生多糖、多肽、黄酮、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、具抗生素作用的多种化合物及植物激素等多种生理活性物质，这些物质分别具有对心血管、肝脏、神经系统、肾、性等人体器官的防病治病作用以及抗癌、消炎、抗衰老、抗菌、抗溃疡等功效[19-21]。以百云6号深层发酵培养物为原料，调配后，未经消毒处理，开放式接种酒精酵母能够顺畅进行酒精发酵，这应与其中所含多糖、果胶、黄酮等活性物质具有抗菌作用有直接关系。邓庆华等[22]考察了黑木耳多糖对霉菌、细菌的抑制活性，结果显示黑木耳多糖对细菌的抑制作用更为明显。

综上所述，以云耳百云6号菌丝液体深层培养物为原料，完全可以酿造出一款色、香、体、味俱佳，营养保健具有的优良发酵酒。发酵酒的研制，最大限度的保留了云耳菌丝液体深层发酵物的营养及活性成分，并且省却了菌丝体提取工序，简化了工艺程序。