过磷酸钙对鸡腿菇胞外酶活性和营养成分的影响

方志荣，林 静，清 源，曹 芮

(1.西昌学院资源与环境学院，四川西昌 615013；2.西昌学院攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室，四川西昌 615013)

0 引言

鸡腿菇(Coprinuscomatus)又名鸡腿蘑，学名毛头鬼伞，属鬼伞科、鬼伞属大型真菌.鸡腿菇口感鲜美，营养成分丰富[1]，含抗癌[2]、抗氧化、降血糖[3]等成分被联合国粮农组织和世界卫生组织确定为集“天然、营养、保健”三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一.鸡腿菇也是一种具备极强的环境适应力的草腐粪生土生菌，其菌丝生理代谢活动活跃，具有较高的纤维素水平分解[4]，抗杂逆性强[5]，可以采用绝大部分农作物秸秆废弃物进行栽种培育.我国是一个农业大国，每年大约产生9.40亿t的秸秆，占全球秸秆总产量的18.50%，其中稻、麦秸秆占有很大的比重[6].稻、麦秸秆均是一种含纤维素、半纤维素、木质素、灰分等物质的复杂天然复合物，适合作为主要原料栽培鸡腿菇[7]，因而采用稻、麦秸秆栽培鸡腿菇可实现农作物废弃物的资源化利用，对促进农业生态环境的健康发展和促进农民增收具有重要的意义.

鸡腿菇发酵料栽培，是一种通过高温堆积的手段把食用菌栽培原料进行发酵，促进栽培料软化，同时生成能够促进菌菇生长的细菌，有助于改善食用菌栽植培育的方式[8].发酵料栽培具有栽培工艺简单、投资少、便于推广等优点.发酵料的质量标准为：发酵结束时有大量白色的嗜热放线菌产生，质地松软、浅褐色、无异味，有芳香味[9].在秸秆发酵的实际操作过程中，由于微生物发酵常常会使得发酵料产生大量氨气，对食用菌菌种产生极大危害，致使菌种不能萌发成活.传统除氨的做法是高温时(60 ℃)在1 m左右的空中用铁锹等抖动发酵混合物散氨，然后摊开降温.这不仅导致大量的氨气散发到空气中，引起环境污染，而且会造成发酵料氮的损失，降低发酵料的质量.

过磷酸钙不仅可以补充培养(基)料中磷素、钙元素，而且可以促进微生物的分解活动，有利于培养料的发酵腐熟[10].此外由于其含有的游离酸可与氨反应，是潜在的堆肥挥发氨气回收固定的吸附剂[11].吴娟等的研究表明添加物料干重10%以上的过磷酸钙可以显著降低堆肥过程中NH3等的排放，增加堆肥产品中总碳和总氮含量[12].李帆等的研究表明添加物料干重5%～15%的过磷酸钙可以有效抑制堆肥过程中铵态氮的挥发损失，增加堆肥的全氮和全磷的含量[13].毛慧玲等研究了过磷酸钙在平菇栽培中的作用时发现因平菇品种不同[14].8%～10%[15]和8%～15%[16]的过磷酸钙被用作辅料加入食用菌栽培基质，促进食用菌的生长.现用发酵料栽培鸡腿菇技术过磷酸钙的使用量一般为：0%～2%[17-18]，发酵混合物中添加5%以上的过磷酸钙对鸡腿菇胞外酶活性、产量和营养成分影响的报道尚少.李超等推荐鸡腿菇发酵料袋式栽培配方中可加入7%的过磷酸钙，但没有胞外酶活性及营养成分等的相关报道[17].本研究通过秸秆发酵料中添加不同比例的过磷酸钙，研究其对鸡腿菇不同生长阶段胞外酶活性、出菇期、生物学效率、品质等的影响，旨在为发酵料栽培鸡腿菇提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验材料 供试菌种为鸡腿菇7号(子实体米白色，广温型品种)，购于武汉周玉麟食用菌研究所；金宝贝10型食用菌栽培料发酵助剂购于北京华夏康源科技有限公司；稻草秸秆采购于西昌市农户.

1.2 试验设计与方法

1.2.1 培养料发酵处理 晒干的稻草，用铡草机切成2～5 cm左右的节段，按照预湿、拌料、建堆、翻堆的方法进行培养料的发酵.过程如下：将粉碎的稻草喷洒1%的石灰水，按照草干物质量1%的比例加入尿素，稻草干物质量的5%(P5)、10%(P10)和15%(P15)添加过磷酸钙，以不添加过磷酸钙(P0)作为对照，同时加入稀释的金宝贝10型食用菌栽培料发酵助剂，将主料与辅料搅拌混匀后，调节混合物料含水率约为60%，pH值8～9.按常规堆置，堆内用直径10 cm左右的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖.当料温上升至65 ℃左右时，可进行第一次翻堆；4～5 d再次翻倒，翻堆3次，发酵18 d待发酵腐熟料表面布满白色菌丝，稻草秸秆轻拉即断，物料呈咖啡色，即完成培养料的发酵处理[9].

1.2.2 鸡腿菇畦栽及管理 在大棚内将发酵好的培养料按照2 kg/m2的用种量采用层播法进行播种，播种厚度30～40 cm分3层播种.上层盖上地膜发菌.播种后28 d，鸡腿菇菌丝布满料层，去掉地膜覆土.在料面上铺上3 cm左右的土，覆盖后浇水，使覆土手抓成团，放手即散，即土壤湿度达到65%左右，再用地膜盖住畦床，待鸡腿菇菌丝体伸出土层时，揭去地膜，进行出菇管理.

1.2.3 生物学相关指标及酶活性测定

(1)菌丝体生长阶段相关指标测定

采样：采用交叉五点取样法，取菌丝体进行营养生长期菌丝体羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性测定.

粗酶液的提取：20 g发菌料加蒸馏水100 mL，25 ℃下浸提4 h，过滤后，4 000转/分钟离心10 min，上清液即为粗酶液.另取20 g发菌料于80 ℃的鼓风干燥箱中烘干至恒重,采用上述方法提取上清液作为对照[19].

羧甲基纤维素酶活性的测定采用DNS比色法[19]，其活力单位为：在50 ℃的条件下反应1 min产生相当于1 ug分子葡萄糖的还原糖的酶量.半纤维素酶的测定采用DNS比色法[19]，其活力单位为：在50 ℃的条件下反应1min产生相当于1 ug分子葡萄糖的还原糖的酶量.漆酶的测定采用邻甲苯胺氧化法[19]，其活力单位为：1 g干物质中的酶含量单位时间内使OD600值改变0.01定义为一个活力单位.淀粉酶的测定采用DNS比色法[19]，其活力单位为：1 g干物质与底物反应1 min释放1 ug葡萄糖定义为一个活力单位.过氧化物酶的测定采用愈创木酚法[19]，其活性单位为：1 g干物质中的酶含量单位时间内使OD470值改变0.01定义为一个活力单位.

(2)子实体生长阶段相关指标测定

待鸡腿菇子实体七八分成熟采收.记录每个处理下鸡腿菇的现蕾时间、首次采菇时间、第一潮菇鲜菇产量，计算不同配方的生物学效率，采集第一潮菇进行干物质、总糖和粗蛋白含量的分析.

生物学效率(%)=鲜菇重(g)/干料重(g)×100%

子实体生长阶段胞外酶活性的测定：按照上述方法采集发菌料，测定子实体阶段菌丝体羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性.

(3)子实体营养成分测定

每处理采集10个子实体，记录子实体的鲜重，将其放入鼓风干燥箱中105 ℃烘10 min，后在80 ℃的条件下烘干至恒重，测其干物质含量.将烘干后的子实体粉碎，过10目筛，材料用于测定粗蛋白含量和总糖含量.粗蛋白含量含量的测定：采用纳氏比色法[20].总糖的测定：先采用盐酸水解后[21]，然后采用蒽酮比色法测定含量[22].

1.2.4 数据统计与分析 利用SPSS 23.0对胞外酶活性和子实体营养成分进行方差分析，并用LSD进行差异显著性检验.

2 结果与分析

2.1 过磷酸钙对鸡腿菇菌丝体和子实体生长阶段胞外酶活性的影响

由表1可知，添加不同量过磷酸钙的发酵料对鸡腿菇菌丝体生长阶段菌丝体胞外酶活性有显著影响.与P0相比，P5，P10，P15显著提高了羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性.羧甲基纤维酶是一类将纤维素分解为葡萄糖的酶，各处理羧甲基纤维素酶的活性大小的顺序为：P10>P15>P5>P0.半纤维素酶可将半纤维素分解为五碳糖、六碳糖和糖醛酸，各处理半纤维素酶的活性大小的顺序为：P5≈P10>P15>P0.漆酶和过氧化物酶是木质素分解相关的酶,可将木质素分解为复杂的小分子化合物，各处理漆酶的活性大小的顺序为：P5≈P10>P15>P0；各处理过氧化物酶的活性大小的顺序为：P5≈P10≈P15>P0.淀粉酶的作用主要是将低聚糖降解为葡萄糖，各处理淀粉酶的活性大小的顺序为：P10>P15>P5>P0.

由表1可知，添加不同量过磷酸钙的发酵料对鸡腿菇子实体生长阶段菌丝体胞外酶活性有显著影响.与P0相比，P5，P10，P15显著提高了羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性.各处理纤维素酶的活性大小的顺序为：P10>P15≈P5>P0；各处理半纤维素酶的活性大小的顺序为：P10>P15>P5>P0；各处理漆酶的活性大小的顺序为：P10>P5≈P15>P0；各处理过氧化物酶的活性大小的顺序为：P10>P5≈P0≈P15；各处理淀粉酶的活性大小的顺序为：P10>P5>P15>P0.

由表1可知，子实体生长阶段羧甲基纤维素酶的活性显著提高，P0、P5、P10、P15羧甲基纤维素酶的活性分别比菌丝体生长时期提高了2.89、2.42、1.21、1.59倍.子实体生长阶段，半纤维素酶的活性降低，P0、P5、P10、P15半纤维素酶的活性分别比菌丝体生长时期降低了58.3%、39.9%、12.6%、34.1%.子实体生长阶段，漆酶活性的变化趋势比较复杂，P0与菌丝体生长阶段无显著差异，P5和P10分别比菌丝体生长阶段下降28.1%和14.8%，P15比菌丝体生长阶段提高22.0%.子实体生长阶段淀粉酶的活性显著提高，各处理淀粉酶的活性分别比菌丝体生长时期提高1.97、2.43倍、69.5%、54.7%.子实体生长阶段过氧化物酶的活性降低，P0、P5、P10、P15的活性分别比菌丝体生长时期降低了34.8%、33.6%、18.2%、47.7%.

表1 过磷酸钙对鸡腿菇菌丝体和子实体生长阶段胞外酶活性的影响

2.2 过磷酸钙的不同添加量对鸡腿菇生物学效率的影响

由表2可知，四个处理中，P10和P5处理组的鸡腿菇现蕾时间和首次采菇时间相比于P0和P10组更短，总的看来在四个处理中P10组的鸡腿菇现蕾时间和首次采菇时间最短；P10组第一潮菇的鲜菇产量最高，但是P5、P15组相比于P0组第一潮菇的鲜菇产量也有所提高；P10组生物学效率最大，但是P5和P15组的生物学效率相比于P0组的也有所提高.结果表明：添加适量的过磷酸钙与P0组相比可以缩短鸡腿菇现蕾和出菇的时间、增加产量和提高生物学效率.在四个处理中，过磷酸钙添加量为10%时，鸡腿菇现蕾和出菇的时间最短，产量最高，生物学效率最大.

表2 过磷酸钙对鸡腿菇生物学效率的影响

2.3 过磷酸钙的不同添加量对鸡腿菇品质的影响

由表3可知，添加过磷酸钙的发酵料显著增加了鸡腿菇干物质、总糖和粗蛋白的含量.各处理间干物质存在显著差异，干物质的大小顺序为：P5>P10>P0>P15.P15处理的鸡腿菇总糖含量最高，其次为P5和P10.鸡腿菇中含有丰富的蛋白质，各处理的鸡腿菇的含量大小的顺序为：P10>P15>P5>P0.与P0相比，P5，P10，P15处理鸡腿菇含量分别提高了22.4%、82.6%、55.0%.

表3 过磷酸钙对鸡腿菇品质的影响

3 讨论与结论

鸡腿菇胞外酶的活性与其自身菌丝体的生长和子实体长成有紧密的关系.菌菇胞外酶活性的高低影响其自身分解能力[23]，倪新江等人发现栽培料中营养物质含量不同只改变胞酶活性的相对大小，变化规律则不改变[24].稻草秸秆中所富含的纤维素、半纤维素和淀粉等大分子物质不能被鸡腿菇直接利用，只有通过其自身分泌相应的胞外酶将以上物质分解成葡萄糖等小分子物质进行吸收利用.赵亚东[19]等人研究测得秀珍菇的羧甲基纤维素酶、淀粉酶，漆酶，过氧化物酶，半纤维素酶活性的提高能够促进秀珍菇子实体的生长发育，张晓昱通过研究香菇胞外酶活性与其自身生产发育的关系得出，胞外酶活性高低影响其产量和品质[25].因此本研究在稻草秸秆发酵料中添加过磷酸钙(特别是P10)，提高了鸡腿菇胞外酶的活性，鸡腿菇能够分解和吸收稻草秸秆中更多的营养物质，促进鸡腿菇菌丝体和子实体的生长发育.

杨文琪等[26]的研究表明菌丝生长时期鸡腿菇主要利用半纤维素，子实体生长时期鸡腿菇利用纤维素为主要营养物质.在本研究中，鸡腿菇子实体生长阶段羧甲基纤维素酶和淀粉酶的活性比菌丝体生长阶段明显提高，半纤维素酶、漆酶(P15除外)和过氧化物酶的活性比菌丝体生长阶段明显下降，这说明鸡腿菇子实体生长阶段主要依靠稻草秸秆中的纤维素获得大量的碳源，这种结果杨文琪等[26]和刘朝贵等[27]对鸡腿菇胞外酶活性的研究结果一致.

除碳源外，鸡腿菇的生长还需要充足的氮源、氨基酸、维生素等营养物质的合成均需要氮素的参与.培养料中不同的C/N将影响鸡腿菇的产量和品质，综合考虑其适宜的C/N为28～32∶1[28-29].堆肥(发酵)料中加入过磷酸钙降低了堆肥(发酵)过程中NH3的排放，增加了堆肥(发酵料)中的总碳和总氮含量[10].P5、P10、P15处理的发酵料中可能含更丰富的氮源，从而为鸡腿菇的营养生长和生殖生长提供了更充足的营养物质，其产量的品质比P0显著提高.P10处理第一潮菇鲜菇产量、生物学效率最高、蛋白质含量最高，可应用于实际生产.