PEAR1不同位点基因突变与双重抗血小板治疗病人预后的相关性分析

王艺臻，高 慧，贾 菲

阿司匹林和氯吡格雷双重抗血小板治疗常用于急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)或接受经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治疗的病人。抗血小板治疗过程中的血小板聚集不同个体之间差异较大，未获得抗血小板药物治疗的病人可能导致高治疗血小板反应性(high on-treatment platelet reactivity，HPR)和不良临床缺血事件，对血小板药物反应过度导致低治疗血小板反应性(low on-treatment platelet reactivity，LPR)和不良出血事件[1-2]。药物反应导致遗传变异性，因此，基因测试可识别携带某些可改变血小板反应性个体化基因(多态性)病人并指导个性化治疗。增加药物剂量或改用替卡格雷或普拉格雷的抗血小板新药治疗LRP是可行的[3-4]。

血小板内皮聚集受体-1(platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1)是一种通过血小板与血小板接触和受体激动剂激活的血小板跨膜蛋白。通过激活的PEAR1依赖GPⅡb/Ⅲa功能传递信号，稳定血小板凝血酶[5-7]。临床研究显示，阿司匹林治疗期间PEAR1基因变异是血小板反应性的决定因素[8-9]。分析环氧化酶1/血栓素A2通路被阿司匹林充分抑制，最大聚合的发生可能依赖于其他信号通路，如PEAR1血小板和血小板的相互作用通路对血小板聚集有影响。病人PEAR1基因突变对采用阿司匹林和氯吡双重抗血小板治疗二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)诱导血小板聚集的影响较少。本研究旨在分析PEAR1不同位点基因突变与双重抗血小板治疗病人预后的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月—2019年10月我院收治的冠心病病人612例，所有病人均接受PCI治疗，同时给予阿司匹林和氯吡格雷双重抗血小板治疗。采用血栓弹性成像法测定血小板聚集，并测定血小板聚集抑制率(IPA)，其中IPA<30%的307例病人作为高治疗血小板反应性组(HRP组)，另外IPA>70%的305例病人作为低治疗血小板反应性组(LRP组)。本研究经医学伦理学会批准，且所有病人均知情同意。所有病人PCI术前均接受300 mg阿司匹林和300 mg氯吡格雷治疗，之后1年内口服氯吡格雷每日75 mg，并终身口服阿司匹林每日100 mg。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 年龄≥50岁；确诊为冠心病；临床资料齐全。

1.2.2 排除标准 年龄<50岁；血小板功能检测结果不全；血小板计数<100×109/L或>300×109/L；血流动力学不稳定；1年内主动出血或有出血事件；出血倾向；口服血小板抗凝药剂等。

1.3 血小板功能 PCI术后12～36 h，抽取病人空腹静脉血于两个真空管中，其中1个真空管中含3.2%柠檬酸三钠抗凝剂，而另1个含锂肝素抗凝剂，真空管颠倒混匀3～5次与抗凝血剂充分混合。采用血小板成像法测定ADP诱导的血小板聚集[11]，采用TEG止血分析仪(Haemonetics Corp，Braintree，MA)和自动化分析软件测量，计算IPA：IPA=100%-100%×[(MAADP×MAFIBRIN)/(MATHROMBIN-MAFIBRIN)]；其中MAADP是ADP诱导聚集强度(抗血小板药物效应的测量)，MAFIBRIN是纤维诱导聚集强度，MATHROMBIN是凝血酶诱导最大聚集强度。

1.4 基因分析 采用HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)选择16个PEAR1的单核苷酸多态性(SNPs)进行分析[12]。HapMap的选择包括次等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05和连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)测定r2阈值为0.8。并采用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)软件进行单体型分析。抽取病人4 mL血样并贮存于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空管中。根据盐析法提取全血样本基因组DNA。选择PEAR1的SNPS采用改良多重连接酶检测反应(improved multiple ligase detection reaction，imLDR)进行基因分型(上海捷斯基生物科技有限公司)测定。同时采用随机重复样本(n=17)和DNA测序进行重复基因分型。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较(见表1)

表1 两组临床资料比较

2.2 两组PEAR1基因型分布 两组16个PEAR1的SNPs频率和Hardy-Weinberg平衡检验是一致的。17个随机重复基因型的符合率和16个SNPs评估的覆盖率分别为100.00%和99.29%，HPR组和LPR组5个SNPs分布不同。HRP组rs11264580次要等位基因C、rs2644592次要等位基因G、rs3737224次要等位基因T和rs41273215次要等位基因T频率高于LPR组(P<0.05)。LPR组rs57731889纯合TT基因型频率高于HPR组(P<0.05)。单因素分析显示：所有的SNPs中，rs11264580、rs2644592、rs3737224和rs41273215与HPR相关，rs57731889与LPR相关。详见表2。

表2 两组PEAR1基因型分布 单位：例(%)

2.3 PEAR1的SNPs与血小板反应性的影响因素Logistic回归分析 以病人是否发生高血小板聚集作为因变量，以REAR1的16个SNPs基因型及病人一般资料作为自变量。将单因素分析中发现的PEAR1的5个SNPs进行多因素Logistic回归分析，进一步确定SNPs与血小板反应性的相关性。回归模型校正了可能影响血小板功能的潜在混杂因素，如年龄、性别、血小板计数、红细胞计数和危险因素等。结果显示，rs41273215位点次要等位基因T与HPR独立相关，rs57731889纯合子TT基因型与LPR独立相关。详见表3。

表3 PEAR1的SNPs与血小板反应性的影响因素Logistic回归分析

2.4 PEAR1的SNPs与血小板反应性的单倍型相关性分析 对5个SNPs(rs11264580、rs2644592、rs3737224、rs41273215、rs57731889)进行单倍型分析，结果表明，5个SNPs单倍型分析中的结合产生8个单倍型。8个单倍型中，CGTTC表达与HPR相关，单倍型TACCT与LPR相关。详见表4。

表4 PEAR1的SNPs与血小板反应性的单倍型相关性分析 单位：例(%)

3 讨 论

PEAR1是一种影响血小板聚集和内皮功能的血小板跨膜蛋白，且PEAR1基因遗传变异可能影响血小板抗血小板治疗前后反应性，并可能发生心血管事件。本研究采用阿司匹林和氯吡格雷对冠心病病人进行ADP诱导血小板聚集，分析其与PEAP1基因的SNPs的相关性。通过单变量分析揭示了次要等位基因C为rs11264580，次要等位基因G为rs2644592，次要等位基因T为rs3737224，次要等位基因T为rs41273215，且单倍型C-G-T-T-C与HPR相关，而rs57731889基因型TT和单倍型T-A-C-C-T与LPR相关。进一步采用多元回归模型对混杂因素进行校正分析，发现rs41273215是HPR的独立预测因素，rs57731889是LPR的独立预测因子。

有研究表明，病人通过口服新型抗血小板药物普拉格雷引起血小板聚集，且发现PEAR1的SNPs中rs11264580、rs3737224和rs41273215与普拉格雷引起的血小板聚集增加有关[13-14]，与本研究结果一致。有研究显示，rs3737224和rs41273215对血小板聚集的重要性[15]。

本研究证实了rs57731889纯合TT基因型与血小板低反应性相关。有研究表明，PEAR1中rs12041331次要等位基因A与胶原诱导的血小板聚集减少存在相关性[16-17]，rs12041331次要等位基因A与氯吡格雷诱导低胶原刺激血小板聚集有关[18]。本研究结果显示，rs12041331次要等位基因A与ADP诱导的血小板聚集减少无相关性(P>0.05)，分析可能是由于不同的激动剂可刺激血小板，提示不同的药物作用途径不同，结论可能存在差异，说明rs12041331的血小板聚集可能是通过胶原介导的受体途径，而不是依赖ADP途径。与以往研究不同，其他几个SNPs在本研究中得到证实，这些基因包括位于PEAR1基因启动子区SNP的rs2768759等位基因C，rs11264579次要等位基因T和rs56260937(C/T)的同义变体。有研究显示，SNP的rs2768759等位基因C与血小板聚集增加有关，不论是ADP、胶原蛋白或肾上腺素激动剂还是阿司匹林治疗[8]。另有研究发现，通过ADP刺激，rs11264579次要等位基因T与高纤维蛋白原结合和P选择素表达相关[12]，且rs56260937(C/T)的同义变异在血小板聚集中发挥着重要作用。本研究涉及的SNPs与血小板反应性相关性无统计学意义，分析可能是由于研究人群、临床因素、环境因素及检测血小板功能方法存在差异导致的。

有研究分析PEAR1多态性和临床结果的关系，认为提高血小板功能的遗传变异可能增加冠心病病人死亡、心肌梗死和脑卒中风险[12]，病人接受阿司匹林和氯吡格雷双重抗血小板治疗后，与GG纯合子相比，rs12041331等位基因A携带者更易发生心血管事件或死亡；单独阿司匹林治疗，rs12041331等位基因A携带者相较于GG纯合子，可能增加心肌梗死风险[19]。因此，PEAR1基因多态性对临床的影响需进一步深入研究，可能需要大样本研究证实临床结论，通过PEAR1基因检测进行个体化治疗，从而改善病人预后，且PEAR1可能是潜在的抗血栓治疗靶点药物。

综上所述，与血小板相关的SNPs中rs2644592、rs41273215、rs57731889为反应性位点，分别位于PEAR1基因的4，15，16内含子区域。rs11264580和rs3737224分别位于外显子区10和12，但为同义突变。推测这些内含子或启动子变异可能为转录因子的结合位点，这些转录因子可能通过携带增强子元件和选择性剪接位点上调基因表达。因此，PEAR1基因在不同位点变化对血小板反应活性影响存在差异，今后需进一步研究揭示PEAR1基因突变、基因表达及血小板之间的相互作用机制。