强心汤对心梗后心衰大鼠CaN-NFAT3信号通路的影响

魏月娟

沧州中西医结合医院，河北 沧州 061000

强心汤是沧州中西医结合医院心内科治疗慢性心力衰竭的经验方，源于真武汤，由附子、补骨脂、淫羊藿、猪苓、茯苓等药物组成，临床治疗效果已被证实，但作用机制尚不明确。血清钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种受Ca2+及钙调素（calmodulin，CaM）调节的多功能信号酶。CaN的活化能够使心肌活化T细胞核因子（nuclear factor activated T3，NFAT3）脱磷酸化，脱磷酸化的NFAT3能够与心肌细胞核内的转录因子相互作用，活化心肌肥大的相关基因，如调节心脏中脑利尿钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、心房利尿钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）等肥大基因特异性表达，导致心肌细胞蛋白核酸合成增加，进而出现心肌肥厚、心腔扩大、心室重构等病理过程［1］。研究［2］显示，CaN-NFAT3的持续激活可导致心肌严重肥大并迅速进展为心力衰竭或死亡。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择正常清洁级雄性SD大鼠64只，每只体质量约200 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物合格证号：SYXK（沪）2006-001：0069937。饲养条件：观察室温度23～25℃，湿度50%～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.2 试药及仪器强心汤，药物组成：黄芪20 g，川芎10 g，桃仁10 g，红花10 g，甘草10 g，熟附子3 g，猪苓15 g，茯苓15 g，白术20 g，白芍15 g，鹿角9 g，骨碎补15 g，由沧州中西医结合医院中药房完成制剂；缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，国药准字H20040217，批号：X1066，规格：号：80 mg/粒）。PCR试剂盒Thermo（F-415xl，批K1622）；cDNA合成试剂盒（MBI公司）；改良的小动物呼吸机（奥尔科特科技生物有限公司）；MLT1050/D型高精度压力换能器（澳大利亚ADI公司）。PowerLab/4SP型生物信号处理分析系统；Chart v 5.0记录和分析软件。

1.3 实验方法

1.3.1 试药制备 药物剂量按大鼠与人体表面积转换系数计算，缬沙坦胶囊制成1.6 mg/mL浓度的缬沙坦悬浊液，强心汤制成含生药浓度2.56 g/mL的制剂。

1.3.2 分组及造模［3］将64只SD雄性大鼠适应性喂养1周后备术，随机分为对照组10只，模型组、缬沙坦组、强心汤组各18只，除对照组大鼠行假手术外，其余各组制备慢性心衰大鼠模型，具体方法为：参照《药理实验方法学》［4］采用结扎左冠状动脉结扎法制备慢性心衰大鼠模型，喂养SD雄性大鼠1周备术，术前1天禁食不禁水，用氯胺酮行腹腔麻醉，固定大鼠，于手术部位脱毛，经口气管插管，连接呼吸机和心电监护。沿左前第3、4肋间切开皮肤，长1.5 cm左右，逐层分离，打开胸腔，暴露心脏，在左心耳下2～3 mm处，用丝线穿过左冠状动脉前降支进行结扎，结扎后左室壁的颜色变白，同时会出现室壁运动减弱，心电监护显示Ⅱ导联R波振幅明显升高，随后ST段亦明显抬高，证实造模成功。待稳定后，关闭胸腔并逐层缝合。对照组大鼠穿线后不行结扎术。所有大鼠术后均连续抗感染治疗3天。

1.3.3 给药方法 术后8周开始灌胃给药治疗，模型组和对照组予蒸馏水灌胃；缬沙坦组予缬沙坦悬浊液灌胃，给药剂量为8 mg/kg；强心汤组予强心汤水溶液灌胃，给药剂量为0.9 g/kg。连续给药4周，每天给药1次。

1.4 观察指标

1.4.1 血流动力学测定［5］灌胃治疗4周后，采用PowerLab/4SP生物信号处理分析系统测定大鼠血流动力学，术前禁食不禁水，称体质量后先用肝素钠（1200 u/kg）抗凝30 min，用3%戊巴比妥钠（35 mg/kg）行腹腔麻醉。将大鼠仰卧固定在手术台上，切开其颈部皮肤，找到右侧颈动脉，分离颈动脉和神经，结扎动脉远心端，在近心端插入PE-50型聚乙烯心导管，通过PowerLab生物信号处理和分析系统记录血流动力学参数；当心导管在颈总动脉中时观测心率，心率稳定后，将心导管推入左心室，再待心率稳定后，记录大鼠左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室压力上升和下降变化最大速度的参数值（±LVdp/dtmax）。

1.4.2 血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平测定1）在完成血流动力学测定后，采集腹主动脉血，将抽取的血液分成两部分，一部分置于抗凝管内，用来分离血浆；另一部分置于普通EP管内，用来分离血清。采用酶联法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）分别测定血浆血管紧张素Ⅱ（plasma angiotensinⅡ，AngⅡ）含量、大鼠钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）的含量，步骤按照试剂盒使用说明书进行操作。2）提取心肌组织，采用Western blot法测定NFAT3蛋白表达量。

1.5 统计学方法使用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学与模型组比较，缬沙坦组、强心汤组LVEDP水平降低（P＜0.05），缬沙坦组+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平降低（P＜0.01），强心汤组LVSP、+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平均升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠左室血流动力学指标比较（±s）

表1 各组大鼠左室血流动力学指标比较（±s）

注：1 mm Hg≈0.133 kPa；与对照组比较，*表示P＜0.01；与模型组比较，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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2.2 血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠血浆血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，强心汤组、缬沙坦组大鼠血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平均明显下降（P＜0.01），且强心汤组中上述指标下调程度均大于缬沙坦组（P＜0.01）。见表2 。

表2 各组大鼠血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠血浆AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*表示P＜0.01；与模型组比较，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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3 讨论

心肌重构是慢性心衰发生、发展的基本病理病机，当各种原因导致细胞内钙离子浓度升高时，能够激活钙调神经磷酸酶-活化的T细胞核因子（calcineurin-nuclear factor activated T，CaNNFAT）信号通路，该通路的活化是心室重构最重要的信号转导通路之一［6］。

心力衰竭属于中医学“喘证”“水肿”等范畴，病机常为心肾为本，五脏相因，水饮瘀血，相兼为患。中医治疗慢性心力衰竭的原则中，多采用温肾利水、补气活血之法［7-8］。强心汤组方中附子能补火助阳，温肾通脉，黄芪补气利水，两药相伍，共为君药；鹿角片、猪苓、茯苓、白术、骨碎补共为臣药，有健脾渗湿，利水消肿，温肾助阳之效，既能使湿从小便而利，减轻心脏前负荷，又可以辅助君药增强温肾功能；川芎、桃仁、红花行气活血化瘀为佐药；白芍与甘草共为使药。全方通补并施，共奏温肾助阳、化气利水、活血化瘀之效。

CaN由一个催化亚基（CnA）和一个调节亚基（CnB）组成，可以受Ca2+及钙调素（calmodulin，CaM）的调节。其中，CnA分为4个不同的结构域，包括催化域、CnB结合域、CaM结合域及自身抑制域。CnB和CaM上均有4个Ca2+结合点位，Ca2+/CaM与CaN结合后，可以使CaN的结构发生改变，活化CaN［9］。可见，CaN为Ca2+下游因子，其蛋白表达水平的改变要早于心肌重构的发生［10］，活化的T细胞核因子（nuclear factor Activated T，NFAT）为CaN的下游因子，在其介导的心肌重构中发挥着重要作用，对心肌肥大、心肌细胞凋亡均有一定的调节作用［11］。总之，Ca2+-CaN-NFAT信号通路能够诱导多种与心肌肥大相关的基因表达，最终导致心肌重构，发展为心衰。众多实验表明RAS系统中的效应分子AngⅡ与心脏扩大参数、心肌肥厚参数呈正相关［12］。有研究显示，CaN的蛋白表达及其酶的活性与AngⅡ水平有着密切关系［13］；而ARB类药物如替米沙坦能够下调CaN和NFAT3的蛋白表达及CaN酶活性，其作用机制是通过抑制AngⅡ激活下游的心肌肥大信号从而影响CaN的活性及表达，最终减少NFAT3的表达［14-15］。

本研究结果显示，强心汤组、缬沙坦组大鼠血浆CaN活性、AngⅡ含量、NFAT3的蛋白质表达量下降，其中，强心汤组下调水平优于缬沙坦组，其治疗慢性心衰的作用机制可能与抑制CaN-NFAT3信号通路有关。