盐酸青藤碱对佐剂性关节炎大鼠NLRP3炎性小体的影响及分子机制的研究∗

姚璐莎，罗常春，张 超

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

盐酸青藤碱（sinomenine，SN）是从中药青风藤中提取的生物碱单体［1］，具有镇痛、抗炎、免疫抑制等药理作用，治疗风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）有确切疗效和较好的安全性，逐渐成为治疗风湿病的一线药物［2］。已有研究表明，体外一定浓度的SN可通过抑制核转录因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性，从而降低大鼠巨噬细胞内肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）mRNA的表达［3］。本课题组前期研究发现，SN对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠关节肥大细胞的表达及其脱颗粒率、血清白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）水平具有明显的抑制作用［4］。此外，其他动物模型和临床研究［5-7］报道，SN可明显抑制巨噬细胞炎性因子的分泌、T细胞和B细胞的增殖，促进细胞凋亡并下调基质金属蛋白酶的表达。核苷酸结合寡聚化结构域受体（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体是一种细胞质内的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、半胱氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、凋亡相关点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）组成，是天然免疫系统的重要组成部分［8］。NLRP3炎性小体参与Caspase-1的活化，促进炎性细胞因子IL-1β、白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）、白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）等促炎细胞因子的分泌，还可调节免疫应答和炎性反应［9］。因此，本研究拟探讨SN对AA大鼠NLRP3炎性小体的影响及其分子机制，以期进一步阐明SN对RA的治疗作用及相关机制，进而为RA的治疗提供新的思路与靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物选用7～11周龄SPF级雄性Wistar大鼠50只，体质量在130～160 g，实验动物合格证号：SCXK2010-0016，由西南医科大学实验动物中心提供，饲养条件：屏障环境中。

1.2 试剂及药品SN粉末（湖南正清制药集团股份有限公司，批号：B21440-20）；雷公藤多苷片（黄石飞云制药有限公司，批号：Z44023753，10 mg/片）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号：F5881）；卡介苗（BCG）（北京生物制品研究所，批号：S10820017，500 mg/支）。IL-18、IL-1β和TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：EH0302）；8-OHdG和MDA检测试剂盒（上海康朗生物技术有限公司，批号：S0131）；实验所用抗体［英国Abcam及美国Cell Signaling Technology（CST）公司，批号：S78465］。

1.3 造模及分组对40只Wistar大鼠进行造模。采用75%酒精消毒大鼠尾部，于尾部中内1/3交界处分6、7点皮内注射弗氏完全佐剂（将BCG与CFA临用前充分摇匀，取适量BCG与CFA经双注射器反复推吸乳化，配置成20 mg的BCG/mL的乳剂）；另设10只为正常对照组，于相应部位注射0.2 mL生理盐水。造模14天后，有40只大鼠出现二次反应，关节炎指数大于4为造模成功，成功率80%。共获得40只成功造模大鼠，将其随机分为模型组，阳性对照组，青藤碱高、低剂量组，每组10只。

1.4 给药方法正常对照组和模型组每天给予生理盐水每天1 mL/100 g灌胃。阳性对照组以雷公藤多苷片碾碎后灌胃：给药剂量为每天4 mg/kg，给药浓度1 mg/mL。青藤碱高、低剂量组予以SN粉末和无菌注射用水混合灌胃：给药剂量为每天20、10 mg/kg，给药浓度1 mg/mL。给药时间均为上午10点，给药4周。

1.5 观察指标

1.5.1 HE染色观察大鼠踝关节组织病理改变 大鼠腹主动脉取血后，迅速用剪刀剪下大鼠右踝关节，置于10%甲醛固定液中固定24 h，一部分石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜下观察踝关节的滑膜增生，炎性细胞浸润以及软骨骨质破坏及关节周围组织水肿等病理学变化，并根据文献［10］进行半定量评分。评分标准：0分：无红肿；1分：个别足趾轻度红肿；2分：大部分足趾关节及足跖红肿；3分：踝关节以下足掌严重红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿。

1.5.2 大鼠关节炎指数 造模后第14天起，每周观察大鼠的关节炎指数（arthritic index，AI）值。AI值根据关节红肿程度参照文献方法进行评定［10-11］。AI=四肢关节评分之和。

1.5.3 ELISA检测血清炎性因子水平 末次给药后，大鼠禁食12 h后处死。用10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，分离腹主动脉取血2 mL，静置30 min，血标本以离心半径8 cm，2000 r/min离心10 min，吸取上清，分别采用ELISA和比色法检测大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的表达水平，检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.5.4 Western blot检测滑膜组织中NF-κB/NLRP3信号通路蛋白表达 处死大鼠后，将其仰位固定，酒精消毒，沿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3 cm×3 cm的区域，以齿镊提起髌骨。沿髌骨上沿约0.3 cm×0.4 cm处向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，打开膝关节腔，可见由髌骨下极向上延续有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，完整剥离滑膜组织。采用蛋白印迹法，分别进行蛋白样本提取制备，SDS-PAGE的制备，灌胶及上样，电泳、转膜、封闭，加入封闭液和一抗NF-κB、NLRP3及二抗（1∶5000）进行免疫反应，最后按0.1 mL/cm2的显影液计算用量，将显影液加在PVDF膜上，暗室曝光，进行显影和图像分析，以目的蛋白与作为内参的β-actin的密度比值作为蛋白的相对含量。

1.6 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠踝关节组织病理表现正常对照组大鼠关节组织有少量散在淋巴细胞浸润。模型组大鼠关节组织与正常对照组大鼠比较，表现出关节炎的典型特点，有不同程度的充血、水肿及炎性细胞浸润，部分出现滑膜细胞、滑膜纤维组织增生。阳性对照组与青藤碱各剂量组，滑膜炎症明显减轻，炎性细胞浸润减少，血管翳形成减轻。病理评分结果显示，与正常对照组大鼠比较，其余各组大鼠关节组织的病理改变积分显著增高（P＜0.05），而阳性对照组、青藤碱各剂量组大鼠病理表现评分均较模型组明显降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠踝关节组织病理表现（HE×400）

2.2 关节炎指数造模后第21、28、35、42天，模型组大鼠的关节炎指数较正常对照组显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组及青藤碱各剂量组大鼠关节炎指数显著降低（P＜0.05）；其中青藤碱高剂量组关节炎指数低于低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点大鼠关节炎指数变化（±s）

表1 各组大鼠不同时间点大鼠关节炎指数变化（±s）

注：#表示与正常对照组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与青藤碱低剂量组比较，P＜0.05；-表示无数值

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2.3 血清炎性因子水平模型组大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平较正常对照组明显升高（P＜0.05），表明造模成功。与模型组比较，青藤碱各剂量组血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平显著降低（P＜0.05）。与阳性对照组比较，青藤碱各剂量组血清炎性因子水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与青藤碱低剂量组相比，高剂量组血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠血清细胞因子的表达变化

2.4 滑膜组织中NF-κB/NLRP3信号通路蛋白表达与正常对照组比较，其余各组大鼠滑膜组织中NF-κB/NLRP3通路相关蛋白的表达明显上调（P＜0.05）。与模型组比较，青藤碱各剂量组NL‐RP3、ASC、IL-1β的表达、caspase-1/caspase-1的比率及IκB、NF-κB的磷酸化显著下调（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠滑膜组织中NF-κB/NLRP3信号通路蛋白表达

3 讨论

RA是一种全身性炎症性疾病，主要表现为身体多关节慢性多发性关节炎、滑膜增生，最终导致功能丧失［12］。RA的病理进展与细胞因子介导的多关节炎症密切相关，导致骨糜烂，甚至关节破坏［13］。然而，临床可用药物主要集中在控制疼痛或炎症方面。目前，在治疗自身免疫性疾病的临床和实验研究方面取得很大的进展。

CFA诱导的大鼠AA是一种实验常用的多关节炎性实验动物模型，大鼠AA表现为滑膜增生、慢性炎症、软骨和骨关节的进行性破坏［14-16］。此外，关节损伤主要是单核细胞浸润所致，降解酶的合成与炎症的产生AA表现为滑膜增生、慢性炎症和软骨、骨关节的进行性破坏［17］。此外，关节损伤主要是单核细胞浸润所致。降解酶的合成及TNFα、白细胞介素等炎症介质的产生IL-1β和IL-6［18］。TNF-α在关节损伤中起着至关重要的作用。RA患者滑膜增生的调解与生产关节炎侵蚀发

病因机制中的趋化因子。IL-1β是一种促炎性细胞子，可引起全身炎症症状，过量的IL-6可促进骨吸收［19］。IL-1β和IL-6在体外可诱导产生TNF-α。本研究采用CFA诱导的大鼠AA模型，分别检测了大鼠血清中IL-18、IL-1β和TNF-α水平以及8-OHdG和MDA含量［20］。结果表明，不同剂量的盐酸青藤碱可显著降低血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的水平，表明盐酸青藤碱对AA具有较好的治疗作用。青藤碱组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明盐酸青藤碱对AA的治疗作用与雷公藤多苷相当。上述结果表明，盐酸青藤碱可显著抑制AA大鼠细胞因子以及氧化应激产物的合成和释放。

巨噬细胞表达黏附分子、趋化因子受体（chemokine receptor，CR）和其他表面抗原，分泌趋化因子、细胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α及生长因子、蛋白酶和其他介质，这些炎症介质是关节炎中炎症和血管新生发生的重要病理机制。根据上述机制［21］，目前已开发出各种细胞因子类生物制剂如IL-1和TNF-α拮抗剂等，对风湿性关节炎具有一定疗效，可有效改善RA患者临床指标和生活质量［22］。然而，大规模临床试验显示，现有的药物只能缓解RA，并不能达到治愈的目的，且仍有许多RA患者对IL-1和TNF-α拮抗剂不敏感，疗效不佳。

炎症是清除体内危险刺激的一种防御反应，炎性小体通过促炎细胞因子的裂解并使其成熟来调节炎症［23］。核苷酸结合NLRP3炎性小体是一种细胞质内的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、ASC、Caspase-1组成，是天然免疫系统的重要组成部分［24］。NLRP3炎性小体参与Caspase-1的活化，促进炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-33等促炎细胞因子的分泌，调节免疫应答和炎性反应。研究显示［25］，激活NLRP3炎性小体需要两个步骤：启动信号，通过NF-кB途径使NLRP3炎性小体和IL-1β前体转录。激活信号，微生物或者危险相关分子模式直接激活炎性小体［26］。

既往研究［27］认为，NLRP3炎性小体的过度激活在代谢性、心血管及肝脏疾病发病过程中起重要作用。而近年来的诸多研究表明，NLRP3炎性小体参与了RA的发病进程。NLRP3炎性蛋白的遗传变异被证实与RA的易感性与严重程度密切相关，抗TNF药物对RA的疗效受NLRP3炎性小体遗传变异的影响。值得一提的是，WANG等［28］在近来发现中国传统中药材仙茅苷A可抑制AA大鼠NFκB/NLRP3通路激活，降低血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、前列腺素E2和丙二醛表达。现代药理学亦证实，中药有较强的消炎止痛作用，同时有免疫调节作用，可降低炎症因子IL-1β、TNF-α改善炎症状况［29-30］；但尚不清楚NF-κB/NLRP3炎性小体通路是否参与了SN对RA的治疗作用。