白藜芦醇对人胎盘滋养细胞氧化应激损伤的影响及机制研究∗

李美和，党慧敏，吴晓玲，刘艳巧，刘润侠，安鹏

西安交通大学第二附属医院（西北医院）

氧化应激（oxidative stress）反映了细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平与抗氧化防御系统之间的失衡。这种不平衡状态在妊娠期各种生殖疾病的发病机制中起着至关重要的作用。因此，抑制氧化应激引起的氧化损伤和凋亡是妊娠疾病的重要干预策略［1］。胎盘的氧化损伤导致炎症和细胞凋亡，由此产生的细胞碎片被释放到母体循环系统中［2］。这些胎盘源性因子作用于母体内皮，导致出现全身内皮功能障碍［3］。人滋养细胞如果受到任何原因引起的氧化损伤，都会使其增殖和侵袭能力下降，胎盘形成和发育异常，最终发生病理妊娠［4］。因此，减少胎盘氧化应激是保障母婴健康的可行策略。

白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种天然的非类黄酮多酚，主要来自葡萄、浆果、花生和其他植物［5］，具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化作用，也可改善代谢性疾病［6］，RES能有效清除超氧化物，在各种病理生理和生物过程中帮助调节细胞凋亡，并可用于治疗慢性疾病［7］，纠正自由基诱导的反应，如DNA损伤［8］、线粒体氧化还原状态失衡［9］、细胞色素P450失活［10］和干扰细胞信号转导［11］。

本研究选取人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为研究对象，在前期实验成功建立滋养细胞氧化应激体外模型的基础上［12］，以抗氧化应激调节剂——RES作为研究对象，明确其在人胎盘滋养细胞氧化损伤中的作用并探寻其可能的药理作用机制。

1 材料及方法

1.1 实验材料人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系（加拿大安大略省皇后大学Charles Graham博士提供）；DMEM/F12培养基、胎牛血清、青链霉素混合液及0.25%胰酶（美国GIBCO公司，批号：8119295，8090485，1989511，1930154）；白藜芦醇及过氧化氢（hydrogen peroxide H2O2，美国Sigma-Aldrich公司，批号：554325，3587191）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号：20200117）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖-毒性检测试剂盒（日本株式会社上海同仁化学研究所，批号：NG703）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（碧云天生物技术研究所，批号：SO101-1）；超氧化物阴离子荧光探针（Dihydroethidium DHE，英国Abcam公司，批号：145360）；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号：7305819）；100 mm培养皿、35 mm培养皿、细胞培养多孔板（美国Corning Costar公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理 将HTR-8/SVneo细胞培养在DMEM/F12培养基中，加入10%灭活的胎牛血清和1%青链霉素混合液，于37°C，5%CO2培养至细胞对数生长期。

1.2.2 造模及分组 应用前期研究已成功建立的滋养细胞氧化应激模型［12］，取对数生长期的HTR-8/SVneo细胞以每孔1×105细胞种植于6孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h细胞贴壁后，给予300 μmoL/L浓度的H2O2处理3 h，构建成功滋养细胞氧化应激模型以用于后续的实验研究。空白对照组不造模。造模成功表现：造模组细胞存活率相比空白对照组明显下降，证实模型细胞既达到了细胞损伤状态，又存有一定的细胞活力，符合细胞实验研究条件要求。将造模成功的细胞，分为模型组，RES 10、50、100、200 μmol/L组，每组设3个复孔。所有实验至少重复3次。

1.3 观察指标

1.3.1 细胞形态 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，弃培养上清，PBS洗2遍后，放于相差倒置显微镜下，于相同的物镜倍数（10×）观察各组的细胞形态学改变并拍照。

1.3.2 CCK-8法检测细胞存活率 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，弃培养上清，加入提前配制好的CCK-8工作液110 μL（CCK-8溶液与培养基体积比为1∶10），置于37℃培养箱继续孵育2 h，在自动酶标仪上检测450 nm波长处各孔吸光度（OD）值。按下述公式计算各组的细胞存活率。

细胞存活率（%）=（实验组OD-空白孔OD）／对照组OD-空白孔OD）×100%

1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，弃培养上清，用0.25%胰酶消化，收集细胞，离心半径1.12 cm，800 r/min离心5 min，用100 μL 1×结合缓冲液重悬，分别加入5 μL Annexin-V PE和5 μL 7-AAD，混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μL 1×结合缓冲液，样品置于冰上，1 h内用采用流式细胞仪［（FACScan™；Becton Dickinson Bioscience，加利福尼亚州圣何塞），配备的Cell Quest™软件（Becton Dickinson生物科学）］检测各组细胞凋亡情况。

1.3.4 检测细胞培养细胞匀浆中SOD含量 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，弃培养上清，按SOD试剂盒说明检测细胞匀浆中SOD含量。

1.3.5 DHE荧光探针检测细胞内ROS水平 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，弃培养上清，冰冷的PBS洗2遍，用1 mL DHE（5 μmol/L）重悬，37℃避光孵育30 min，离心半径1.12 cm，800 r/min离心3 min，冰冷的PBS洗2遍，用200 μL PBS重悬，用流式细胞仪进行检测，结果用平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示，MFI数值高低与细胞内ROS水平呈正比。

1.3.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞中caspase-3及Bcl-2水平 各实验组对应处理后，继续培养8 h后，吸取培养上清，采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用 抗 人（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）及（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的caspase-3及Bcl-2与单抗结合，加入生物素化的抗人caspase-3及Bcl-2，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450 nm处测OD值，caspase-3及Bcl-2浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中caspase-3及Bcl-2浓度。

1.4 统计学方法采用GraphPad Prism 8软件（GraphPad软件公司）进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态空白对照组细胞呈细长纺锤形，边界清晰，胞浆饱满，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞贴壁较多。模型组细胞形态发生改变，细胞皱缩、间隙增宽，有些呈片状坏死脱落，但仍存活相对较多细胞。RES 10 μmol/L组，在8 h的时间节点观察细胞形态较模型组均无明显改变；RES 50 μmol/L组细胞形态结构趋于正常、细胞轮廓清晰，细胞呈长梭形，贴壁较牢，胞浆饱满；RES 100、200 μmol/L组细胞形态完整性欠佳，细胞均匀度、核仁清晰度下降，细胞数逐渐减少，呈片状坏死脱落，存活细胞较少。见图1。?

图1 电镜下各组细胞形态（×10）

2.2 细胞存活率与空白对照组比较，模型组细胞的存活率降低（P＞0.05）。与模型组比较，RES 10 μmol/L组的细胞的存活率降低不显著（P＞0.05）；RES 50、100 μmol/L组细胞存活率显著提高（P＜0.01），且RES 50 μmol/L组的细胞存活率高于RES 100 μmol/L组（P＞0.05）；RES 200 μmol/L组的细胞存活率较模型组明显下降（P＜0.05）。见表1。

2.3 细胞凋亡率与空白对照组比较，模型组细胞的凋亡率明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，RES 10、50 μmol/L组随剂量增加细胞凋亡率逐渐降低趋势，且RES 50 μmol/L组的凋亡率明显低于模型组（P＜0.01）；RES 100、200 μmol/L组的细胞凋亡率均明显升高（P＜0.01），表明该RES浓度作用下引起了较为明显的滋养细胞坏死和凋亡。见表1，图2。

图2 各组细胞凋亡率

表1 各组细胞存活率及细胞凋亡率比较（±s）

表1 各组细胞存活率及细胞凋亡率比较（±s）

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.05；&表示与模型组比较，P＜0.05；F、P为模型组与RES 50 μmol/L组比较统计值

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2.4 细胞SOD水平与空白对照组比较，模型组SOD水平明显下降（P＜0.01）。与模型组比较，RES 10、50、100 μmol/L组SOD活性升高明显（P＜0.01）；RES 200 μmol/L组SOD的活性与模型组相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组细胞匀浆中SOD、ROS水平比较（±s）

表2 各组细胞匀浆中SOD、ROS水平比较（±s）

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.05；&表示与模型组比较，P＜0.05；F、P为模型组与RES50 μmol/L组比较统计值

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2.5 细胞ROS水平与空白对照组比较，模型组细胞MFI值明显增高（P＜0.01）。与模型组比较，RES 10、50、100 μmol/L组MFI值均下降（P＜0.05），且RES 50 μmol/L组的MFI值较RES 100 μmol/L组降低更显著（P＜0.01），RES 200 μmol/L组MFI值明显升高（P＜0.01）。见表2，图3。

图3 各组细胞ROS水平图

2.6 细胞caspase-3、Bcl-2水平与空白对照组显比较，模型组细胞中caspase-3、Bcl-2水平均明升高（P＜0.001）。与模型组比较，RES 50 μmol/L组caspase-3、Bcl-2水平明显低于模型组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞内caspase-3及Bcl-2水平比较（±s） pg/mL

表3 各组细胞内caspase-3及Bcl-2水平比较（±s） pg/mL

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.05；&表示与模型组比较，P＜0.05；F、P为模型组与RES 50 μmol/L组比较统计值

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3 讨论

滋养细胞的正常增殖和生物学功能是成功妊娠的先决条件，胎盘血管在胎儿-母体界面上的营养、气体和废物交换起着至关重要的作用，其发展依赖于血管生成信号和相关生长因子的正确表达和相互作用。氧化应激在各种妊娠生殖疾病的发病机制中起着重要作用，胎盘血管发育受损可能与子痫前期的发病机制有关，氧化应激增加可能是子痫前期发病的原因之一［13］。

研究表明，妊娠疾病与滋养细胞功能损害或缺陷有关，凋亡和自噬的异常变化是促进滋养细胞功能损害或缺陷，导致胎盘形成缺陷或子痫前期的重要因素［14］。胎盘灌注不足、缺血缺氧可导致机体产生大量ROS［15］，进而诱导大量滋养层细胞死亡，最终导致妊娠疾病等病理损伤。因此，深入研究滋养细胞氧化应激，有助于阐明流产、先兆子痫、胎儿生长受限等一类原发性滋养细胞疾病的发病机制，为这些疾病的治疗提供新的治疗靶点。

天然来源的化合物由于其固有的抗氧化活性，长期以来被认为可以减轻氧化应激。例如姜黄根中的姜黄素、葡萄中富含的白藜芦醇等，这些化合物在治疗心血管疾病和肥胖等疾病时都可以通过减少氧化应激从而对细胞产生保护作用［16］。这些天然化合物在许多疾病中都可以减少氧化应激的细胞保护作用。然而，白藜芦醇作为一种公认的抗氧化剂，对胎盘滋养细胞氧化应激损伤的影响尚未被阐明。我们利用HTR-8/SVneo细胞与H2O2共同孵育，通过诱导建立氧化应激损伤模型，护观察RES对该细胞氧化应激和凋亡是否存在保作用。

细胞内的抗氧化系统可以抵抗氧化应激，包括不同的自由基清除抗氧化酶和非酶抗氧化剂。SOD是最重要的抗氧化酶，SOD将超氧化物转化为H2O2。SOD等抗氧化酶可降低细胞内ROS水平［17］。当ROS及SOD水平失去平衡时，ROS可产生一系列自由基，改变细胞的抗氧化防御能力，导致细胞膜、细胞蛋白、DNA的氧化损伤，最终导致细胞凋亡，随后不同的器官系统表现出组织损伤［18］。近年的研究［19-20］结果显示，缺乏充分调控的ROS被认为是导致胎盘病理、妊娠紊乱和早产的主要原因。以往研究［21］表明，白藜芦醇具有抗炎、抗氧化作用，能够抑制ROS的产生，其抗氧化和细胞保护作用于多种疾病，如癌症、心血管疾病和神经系统疾病［22-23］。本实验研究结果表明，RES预处理后能降低细胞ROS的生成，提高抗氧化酶活性，减少氧化应激的发生，进而减少与此相关的组织破坏［24］。

细胞凋亡是多细胞生物生长和健康的正常过程，是在细胞受到充分损伤后发生的［25］。此外，细胞凋亡还参与了多种病理过程［3］。因此，抑制细胞凋亡是一种潜在的治疗疾病的策略。Bax和Bcl2是细胞凋亡的调节因子。Bax是凋亡诱导剂，而Bcl2则是激活存活信号。有研究［4］发现，活性氧所致的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节。当细胞处于氧化与抗氧化失衡状态时，ROS大量生成，ROS可激活Bax等促凋亡蛋白激活，造成线粒体通透性转换孔开放，也可以直接攻击线粒体膜，通过脂质过氧化反应造成损伤，激活下游Caspase途径，导致细胞凋亡［8］。已有研究［26］表明，白藜芦醇有助于调节多种疾病的病理、生理和生物学过程的凋亡，其作为一种抗氧化剂，对细胞凋亡的抑制作用也已有多项研究报道［27-28］。本实验结果表明，H2O2对滋养细胞有明显的氧化应激损伤作用，而将RES作用于H2O2诱导的发生氧化损伤的滋养细胞后，可显著降低细胞中Caspase-1和Bcl-2的活性，减少细胞凋亡率，抑制细胞凋亡，增加滋养细胞的存活率。

此外，本实验研究发现，RES 200 μmol/L处理组对HTR-8/SVneo氧化应激细胞没有保护作用，反而有促进细胞凋亡和损伤的作用，其作用机制可能与高剂量的RES产生的细胞毒性作用有关。有研究显示［29］，抑癌基因p53在RES作用下被激活，并参与结肠癌细胞凋亡过程。另外RES诱导DNA损伤如双链断裂。本研究观察到的结果与此前的报道相一致。

综上所述，本研究结果表明，50 μmol/L RES作用8 h可以通过抗氧化和抗凋亡作用，减轻HTR-8/SVneo细胞的氧化应激和凋亡，从而保护细胞免受H2O2的损伤，具有预防和治疗H2O2诱导的HTR-8/Svneo细胞氧化应激损伤的应用前景。但其对于下游途径的作用机制尚不明确，有待于进一步研究。