基于网络药理学分析荆芥—防风药对的分子作用机制∗

吴春凤，黄艳霞，郑景辉

1柳州市人民医院，广西 柳州 545006；2广西中医药大学瑞康医院

荆芥和防风是经典的祛风解表药对，以其作为君药的众多复方广泛用于呼吸系统疾病、皮肤病的治疗。荆芥味苦性温，归肝肺经，善祛风解表、透疹、止血［1］。药理研究表明，其有效成分挥发油、黄酮类及萜类化合物具有解热［2］、抗炎［3-4］、镇痛［5］、抗菌抗肿瘤［6-7］等作用。防风味辛、甘，归肝、脾、膀胱经，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉等作用，临床常用于治疗外感表证、风疹瘙痒、风湿痹痛等［8］。药理研究表明，防风具有抗炎［9］、镇痛、镇静［10］、抗肿瘤［11］、调节机体免疫、抗血栓［12］等作用。荆芥与防风有相似的药理作用，两药相须为用，相辅相成，共奏发寒散邪之功。研究表明，表邪是外邪侵入人体肌肤所引起的症候群，即上呼吸道感染和传染病初期的症状。研究证实，解表药的解表功效与抗炎作用相类似，而病毒属于中医学六淫范畴，是引起表证的主要病因之一，因此解表药的药理作用研究主要体现在抗炎、抗病毒及抗过敏方面［13］。药理学研究证实了荆芥-防风药对具有解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒等作用，而对其为什么能解除表证的研究尚不能全面、深入阐释其作用机制。本研究以系统生物学为指导，应用网络药理学技术，从整体水平上分析“药物-靶点”“靶点-靶点”“分子-细胞-生物过程-信号通路”复杂网络关系，推导荆芥与防风这组药对祛风解表的可能作用机理，为利用现代科学方法、丰富和发展中医药，实现中药现代化提供参考。

1 资料与方法

1.1 对荆芥-防风药对化学成分的收集及活性化合物的筛选从中药系统药理学数据库（traditional Chinese medicines systems pharmacology platform，TCMSP）（http：//lsp.Nwsuaf.Edu.cn/tcmsp/php），检索荆芥-防风药对的化学成分，筛选出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18［14-15］，的候选化合物成分，作为荆芥-防风药对的活性化学物。

1.2 收集荆芥-防风活性化合物的靶点蛋白及构建化合物-靶点蛋白网络图通过TCMSP和DrugBank数据库，检索荆芥-防风药对活性化合物的靶点蛋白，将预测靶点蛋白导入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），检索并剔除重复、非人源靶点，并转化为活性化合物规范的靶点蛋白的基因标识符（gene symbol）。将荆芥-防风药对活性化合物及其对应靶点蛋白信息导入Cytoscape 3.7.0软件，进行可视化并计算网络拓扑学参数，构建荆芥-防风活性化合物-靶点网络。

1.3 构建靶点蛋白相互作用网络图（protein protein interaction，PPI）将荆芥-防风药对活性化合物的靶点蛋白输入STRING 10.5在线软件（http：//string-db.org）检索框中，限定研究物种为“Homo spaiens”，设置打分值高于0.9的最高置信度的数据，获得PPI及互作信息，将结果导入Cytoscape 3.7.0（http：//www.Cytoscape.org/）软件进行可视化及网络拓扑学分析，PPI图中节点的颜色、大小反应节点Degree值，边的颜色、粗细反映节点间Combined score值。本研究基于以下参数：平均最短路径（average shortest path length，ASPL）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、中心接近度（closeness centrality，CC）、聚类系数（clustering coefficient，CC）、连通度（degree），以评估节点在网络中的重要程度。

1.4 基因本体（gene ontology,GO）及信号通路分类将荆芥-防风活性化合物靶点上传到David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），以人类全基因组为背景基因和参照集合，进行GO的生物学 过 程（biological process，BP）、细 胞 组 成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析和KEGG信号通路分析。利用Cytoscape 3.7.0软件计算出富集因子并绘制气泡图。

2 结果

2.1 化学成分及活性成分筛选在TCMSP数据库中检索出与荆芥有关的化学成分有159种，与防风相关的化学成分有173种，两者含有31种相同成分，故而从荆芥-防风药对共检索出相关化学成分301种。通过口服生物利用度和类药性分析发现：在荆芥和防风中，分别有11、18种化合物表现出良好的口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）和谷甾醇（sitosterol）为荆芥和防风共有化合物，故荆芥-防风药对共筛选出27种活性化合物。见表1。

表1 通过OB和DL预测的荆芥-防风中的27种活性化合物信息（荆防散有效成分表）

2.2 化合物-靶点相互作用网络分析在TCMSP和DRUGBANK数据库中分别检索“荆芥-防风”药对27种活性化合物的相关靶点蛋白，其中槲皮素（quercetin）相关靶点最多（154个），其次是木犀草素（luteolin）靶点57个、β-谷甾醇（beta-sitosterol）靶点46个、汉黄芩素（wogonin）靶点45个、豆甾醇（stigmasterol）靶点31个，而角鲨烯（supraene）在上述两个数据库中还未有相关靶点。总共检索出509个靶点，剔除重复的、非人源的靶点，结合Uniprot数据库确认及转换，最终共得到208个靶点。利用Cytoscape软件构建“荆芥-防风”药对活性化合物-靶点相互作用网络，网络中包含234个节点（2个化合物和208个潜在靶标）和504条边。在网络中，粉色节点代表靶点，蓝色节点代表化合物，一个节点的度（degree）表示网络中和节点相连的路线的条数。经过Network analysis分析，得出208个靶点在网络中的度（degree），其中前列腺素过氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）度值最大（23），其次为丝氨酸蛋白酶（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、F2（prothrombin，F2）、HSP90（heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90）、PTGS1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1）、NCOA2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、SCN5A（sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A）等，这些度值（连通度）高的药物化合物度值越大，在荆芥-防风药对的药理功能中发挥重要作用的可能性越大。见图1。

图1 荆芥-防风药对化合物成分-作用靶点网络图

2.3 潜在靶点的拓扑学分析将208个潜在靶点导入string软件中构建PPI网络，将得到的蛋白互作网络导入Cytoscape软件进行网络拓扑属性分析。荆芥-防风药对潜在靶蛋白PPI网络有118个节点（90个靶蛋白未参与蛋白的相互作用），经计算后可知，平均连通度约为4.068，平均最短路径长度为3.074，平均介数约为0.058，平均聚类系数约为0.314。度值大的节点被认为是中心节点，其中度值超过平均数的节点有35个，说明这35个节点作为蛋白互作网络中的核心节点，可能是荆芥-防风药对化合物作用的关键靶标。见图2、表2。

表2 荆芥-防风药对潜在靶点的网络拓扑属性

图2 荆芥-防风药对化学成分靶点蛋白的PPI网络图

续表2

2.4 荆芥-防风药对作用关键靶点的GO分析和KEGG分析将荆芥-防风药对35个关键靶点导入David数据库进行GO分析和KEGG分析。经过Bonferroni校正P值小于0.05，GO富集分析得到127个生物学过程，包括一氧化氮生物合成过程的正调控、对药物的反应、凋亡过程的负调节、DNA模板转录的正调控、对乙醇的反应等；20个细胞组成，包括核浆、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞质、细胞外间隙、细胞液等；31个分子功能，包括识别蛋白结合（identical protein binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、酶结合（enzyme binding）、一氧化氮合成酶调节活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、蛋白质复合物结合（protein complex binding）等，GO分析注释见图3。KEGG通路富集分析显示荆芥-防风药对35个关键靶点涉及80条信号通路，包括：肿瘤信号通路（tumor signaling pathways）、乙肝病毒（hepatitis B）、膀胱癌（bladder cancer）、I型人类嗜T细胞病毒感染（HTLV-I infection）、小细胞肺癌（small cell lung cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、p53信 号 通 路（p53 signaling pathway）等。荆芥-防风药对的作用靶点涉及多种生物过程及多条通路，说明荆芥-防风药对可以通过调节这些生物过程和通路来发挥治疗作用。见图3—4。

图3 荆芥-防风作用靶点的GO分析

2.5 荆芥-防风药对作用关键靶点生物学过程及信号通路聚类分析对荆芥-防风药对的35个关键靶点参与机体的生物学过程进行聚类，可将其大致分为细胞代谢过程、血管生成和收缩、炎症反应、免疫反应和氨基酸磷酸化的调控等。荆芥-防风药对的35个关键靶点作用的信号通路共富集出80条，包括癌症信号通路、PI3K/AKT信号通路、P53信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等，且这些通路是多个靶点共同调控的，如35个关键靶点中有16个靶点（PTEN、CDK2、AKT1、CCN D1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等）富集在PI3K/AKT信号通路上，见图5。推测荆芥-防风可能通过这些关键靶点参与到炎症反应、免疫反应等生物学过程和调控相关通路发挥治疗作用。见图5。

图5 荆芥防风药对16个关键靶点在PI3K/AKT信号通路中的分布图

图4 荆芥-防风药对有效化合成分作用的核心靶点的KEGG分析气泡图

3 讨论

本研究采用网络药理学方法对荆芥和防风的主要活性成分、作用的靶点、参与的生物学过程及靶点涉及的信号通路进行了探讨。根据ADME利用TCMSP数据库找寻到荆芥-防风药对共27种有效活性成分，其中槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、汉黄芩素、豆甾醇等可能是荆芥-防风发挥疗效的主要活性成分。槲皮素作为一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物，具有多重生物活性，有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用，在细胞和动物实验中可以用来治疗肝、心、脾、肺、肾、骨髓系统、神经系统疾病等［16］。木犀草素有抑菌抗病毒、降血糖血脂的功效，在免疫调节、镇痛抗炎、抗肿瘤方面有良好的效果［17］。汉黄芩素是一种来源于纯天然中草药的黄酮类化合物，近年来，汉黄芩素在抗肿瘤和免疫调节方面的作用得到了关注，CUSICK等［18］用小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV）建立C57BL/6小鼠中枢神经系统感染的模型，在小鼠感染病毒24 h后分别用汉黄芩素和抗中枢神经系统感染药米诺环素进行腹腔注射，发现二者均能够明显减少小鼠大脑中巨噬细胞的浸润。由此推测荆芥防风通过这些有效活性成分发挥抗炎、抗病毒等作用。对荆芥防风的作用靶点进行拓扑属性分析后，筛选出来35个关键靶点，这些靶点参与了机体众多生物学过程，聚类后大致分为细胞代谢过程、血管生成和收缩、炎症反应、免疫反应和氨基酸磷酸化的调控等。富集出来的通路有80条，包括癌症信号通路、PI3K/AKT信号通路、P53信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等，并且这些通路是多个靶点共同调控的，如PTEN、CDK2、AKT1、CCND1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等16个靶点富集在PI3K/AKT信号通路上。推测荆芥防风可能通过这些关键靶点参与到炎症反应、免疫反应等生物学过程和调控相关通路，发挥治疗作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法探讨了荆芥-防风药对的有效活性成分、关键的作用靶点和参与的生物学过程以及信号通路，与现代药理研究相符，本研究是通过现有的文本挖掘和大数据来进行预测，研究可能存在一些局限性，如数据库不够完整、评判标准不一的问题，因此，后期有必要通过基础实验加以完善。