结核分枝杆菌膜蛋白MmpS5-MmpL5的表达及功能研究

李东硕 王彬 陆宇 徐建

贝达喹啉(bedaquiline，Bdq)能够抑制结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成酶，有着重要的灭菌活性，是缩短结核病疗程和治疗耐药结核病的关键新药[1]。2018年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将Bdq列为治疗耐多药结核病(MDR-TB)或利福平耐药结核病(RR-TB)的A组药物[2]。Bdq的临床耐药株很快出现[3-4]，迫切需要对其耐药机制进行深入研究，以便在临床大规模使用该药品时，能够合理用药，降低耐药率的发生。

尽管编码ATP合成酶的atpE基因突变与Bdq耐药相关，但在Bdq治疗的临床患者中分离的很少。临床上首先发现且报道最多的是Rv0678基因突变[3-5]。笔者前期研究也在中国MDR-TB患者中分离到了Bdq和氯法齐明的原发耐药株，发现MTB的Rv0678突变会导致其对Bdq与氯法齐明的交叉耐药[6]。Rv0678基因是MmpS5-MmpL5系统的转录抑制因子，Rv0678基因突变会引起外排泵基因mmpS5及mmpL5的过表达。

MmpL5是多重跨膜的膜蛋白，其蛋白结构尚无解析，MmpS5-MmpL5的功能尚不清楚。膜蛋白的表达与纯化一直是研究膜蛋白功能的技术难题。笔者前期在大肠杆菌中多次尝试表达但结果仍不理想。考虑到耻垢分枝杆菌基因组与MTB高度同源，耻垢分枝杆菌属快生长分枝杆菌且具有无致病性及传染性等优点，笔者采用耻垢分枝杆菌作为模式菌研究，对pMV261载体进行改造，在载体上插入用于调控乙酰胺酶表达的可诱导型启动子，构建了MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达体系，并对其功能进行了研究，以期为后续蛋白纯化并研究Bdq的转运机制奠定基础。

材料和方法

一、实验菌株

MTB标准株H37Rv(ATCC 27294)和耻垢分枝杆菌MycobacteriumsmegmatisMC2155(ATCC 700084)由首都医科大学附属北京胸科医院/北京市耐药结核病重点实验室保存并提供。

二、实验药物

Bdq(上海瀚香生物科技公司；批号：20200518；纯度≥98%)、异烟肼(美国Sigma公司；批号：MKBV9475V；纯度≥99%)。

三、 仪器与试剂

1.仪器：Nuaire701二氧化碳恒温培养箱(美国Nuaire公司)、Infinite 200多功能酶标仪(瑞士Tecan 公司)、GENEPRO多功能基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司)、Amersham Imager 600蛋白成像仪(美国GE公司)、Max-Q8000低温摇床(美国赛默飞世尔科技公司)、DS-11FX超微量分光光度计(美国DeNovix公司)、Tanon-4200全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

2.试剂：pMV261质粒为本实验室保存；KpnⅠ(R0142V)、BamHⅠ(R0136V)、EcoRⅠ(R0101V)、HpaⅠ(R0105V)、HindⅢ(R0104V)均购自美国纽英伦生物技术公司；E.coliDH5α购自宝生物工程(大连)有限公司(批号：R2015V)；pLB零背景快速连接试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(批号：VT205)；ATP检测试剂盒(S0026)、特超敏ECL化学发光试剂盒(P0018AS)、苯甲基磺酰氟(PMSF；ST506)、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033)均购自上海碧云天生物技术有限公司。

四、构建带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体pMV261s

采用PCR的方法从耻垢分枝杆菌中扩增乙酰胺酶基因，引物序列如下：AI-F：5′-ctaggtaccagtgacgcggtctcaagcg-3′(KpnⅠ)，AI-R：5′-ctaggatcc-aaaactacctcgggcatgtgg-3′(BamHⅠ)，下划线处为酶切位点。PCR反应后目的基因与pLB克隆载体连接，目的片段经琼脂糖凝胶电泳回收与pMV261载体双酶切后连接。设计一段在N端含有6×His组氨酸标签的序列，并引入BamHⅠ及HpaⅠ的酶切位点黏性末端，序列如下：261-F：5′-gatcctcaccaccaccaccaccacactagtcagctgcagaattcatatgcatcgatggtt-3′(斜体标示序列为6×His组氨酸标签序列)；261-R：5′-aaccatcgatgcatatgaattctgcagctgactagtgtggtgg-tggtggtggtgag-3′，将上述质粒经BamHⅠ及HpaⅠ双酶切后，与此序列连接，构建带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体，命名为pMV261s。

五、目的基因与pMV261s的连接及转化

根据NCBI中MTB标准株H37Rv的mmpS5及mmpL5的基因序列设计引物，引物序列如下：mmpS5-F：5′-ccggaattcgatgattggaactctcaagc-3′和mmpL5-F：5′-ccggaattcgatgatcgtgcaaaggac-3′ (EcoRⅠ)；mmpL5-R：5′-ccggttaactcagaccaaggcgaagg-3′(HpaⅠ)；构建mmpS5-mmpL5全长基因，前引物为mmpS5-F，后引物直接为mmpL5-R。PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，pLB载体过夜连接提取目的基因。EcoRⅠ及HpaⅠ双酶切的目的基因与pMV261s载体连接，转化连接产物至E.coliDH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并测序验证。

将测序验证正确的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的质粒及空质粒电转入耻垢分枝杆菌感受态细胞，电转条件为电压2500 V、电容25 μF，电阻1000 Ω，电转化杯厚度2 mm。转化后于含10% OADC添加剂的7H9培养基中37 ℃恒温摇床继续培养4 h，吸取一定体积涂布在含终浓度为50 μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取单克隆于7H9+10% OADC+50 μg/ml卡那霉素培养基培养。

六、MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的表达

待菌液培养至波长600 nm处吸光度值(A600值)等于0.8，加入终浓度为0.2%的乙酰胺溶液诱导蛋白表达，37 ℃条件下继续培养20 h，收集诱导表达后的菌液，离心后弃上清，菌沉淀用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，离心弃上清，菌沉淀加入细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂A和PMSF，悬浮后冰浴10～15 min，高压破碎仪破碎菌体，4 ℃ 1200×g离心10 min，收集上清液，继续14 000×g离心30 min，吸除上清，沉淀加入膜蛋白抽提试剂B，振荡后冰浴，14 000×g离心5 min，抽提膜蛋白。

七、蛋白免疫印迹分析

提取的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h，加入1∶2000的抗组氨酸鼠源IgG单克隆抗体一抗，TBST缓冲液洗去一抗，加入1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST缓冲液洗去二抗，加入辣根过氧化物酶显色剂孵育后，进行化学显色检测。

八、生长曲线的测定

为了验证外源基因表达对耻垢分枝杆菌生长的影响，测定了空质粒、表达MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌株的生长曲线。将这3种细菌培养至对数生长期后，调整A600值一致，之后按1%接种在含0.05%吐温-80的7H9+10%OADC培养基中，37 ℃恒温摇床继续培养，每隔5 h测定1次A600值，每个样品设置2个生物学重复，绘制生长曲线。

九、检测抗菌药物对耻垢分枝杆菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)

将3种细菌培养至对数生长期，用7H9+10%OADC培养基将菌液稀释至终浓度为1×105CFU/ml。取96孔黑色培养板，依次将异烟肼及Bdq倍比稀释。37 ℃培养3 d后，各孔加入20 μl的阿尔玛蓝和12.5 μl的20%吐温-80，37 ℃继续培养24 h，记录各孔颜色，蓝色表示菌株无生长，红色表示有菌生长，MIC表示由蓝色变为红色的的最低药物浓度。

十、耻垢分枝杆菌对溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)的积累实验

MmpS5-MmpL5蛋白属于RND超家族外排泵，EtBr常被用作测试药物外排泵活性的通用型底物。离心收集培养至对数生长期的3种细菌，并用PBS重悬洗涤菌体2次，调节各菌A600值为0.4，吸取198 μl重悬菌液，加入2 μl浓度为100 μg/ml的EtBr至终浓度为1 μg/ml，混匀，立即用Infinite M200多功能酶标仪检测荧光值，设置激发波长为545 nm，发射波长为590 nm，每隔5 min检测1次，共检测60 min，设置3个生物学重复。

十一、耻垢分枝杆菌ATP含量测定

取培养至对数生长期的3种细菌，用7H9培养基调节A600值为0.4，向菌液中加入终浓度为1/2 MIC(0.125 μg/ml)的Bdq，孵育24 h，离心收集等体积的3种细菌，离心后弃上清，菌沉淀加入裂解液，振荡混匀。96孔黑色培养板中加入100 μl裂解菌液和100 μl稀释后的ATP检测液，酶标仪测定相对光单位(relative light unit，RLU)值，根据标准曲线及测定的RLU值计算出各菌液中的ATP含量。

十二、统计学处理

结 果

一、带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型载体pMV261s的构建

通过改造pMV261穿梭载体，添加乙酰胺酶启动子基因(pACE)，并添加组氨酸标签便于重组蛋白的验证及纯化，建立带有组氨酸标签的乙酰胺可诱导型表达载体pMV261s。对耻垢分枝杆菌乙酰胺酶启动子基因进行PCR扩增，片段长度为2618 bp(图1)，连接pLB克隆载体成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ双酶切后目的条带大小正确(图2)，在乙酰胺酶启动子基因上有HindⅢ酶切位点，在含组氨酸标签的序列上有EcoRⅠ酶切位点，双酶切后片段长度为1584 bp(图3)。由此证明组氨酸标签连接成功，同时测序验证正确，pMV261s载体构建成功。

注 泳道M为DL 5000 DNA Marker；图1中泳道1和2均为pACE基因；图2中泳道1为pLB-pACE载体单酶切，泳道2和3均为pLB-pACE载体双酶切验证；图3中泳道1为pMV261s载体单酶切，泳道2和3均为pMV261s载体双酶切验证图1～3 带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型pMV261s载体的构建

注 泳道M为DL 5000 DNA Marker；图4中泳道1和2均为mmpL5基因；泳道3和4均为mmpS5-mmpL5基因。图5中泳道1为pMV261s-mmpL5载体单酶切；泳道2为pMV261s-mmpL5载体双酶切。图6中泳道1为pMV261s-mmpS5-mmpL5单酶切；泳道2为pMV261s-mmpS5-mmpL5双酶切图4～6 目的基因与pMV261s载体的连接与验证

二、pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5表达载体的构建

PCR方法扩增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片段长度为2895 bp，mmpS5-mmpL5片段长度为3320 bp，目的基因条带大小正确(图4)，EcoRⅠ和HpaⅠ双酶切目的基因及pMV261s表达载体，双酶切条带大小正确(图5，6)，测序结果无突变。

三、MmpS5-MmpL5及MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达

注 泳道1为pMV261s-mmpS5-mmpL5重组菌株；泳道2为pMV261s-mmpL5重组菌株；泳道3为pMV261s菌株；泳道M为蛋白质相对分子质量标准图7 蛋白免疫印迹分析重组耻垢分枝杆菌的MmpS5-MmpL5和MmpL5蛋白

对经乙酰胺诱导的pMV261s-mmpL5、pMV261s-mmpS5-mmpL5重组菌株及pMV261s空质粒菌株进行蛋白免疫印迹分析，MmpL5蛋白相对分子质量为104 800，MmpS5-MmpL5蛋白相对分子质量为120 100，加上6×His组氨酸标签组成的重组蛋白，在相对分子质量为110 000～130 000处出现目的条带，而空质粒菌株没有条带(图7)，表明MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝杆菌中成功表达。

四、MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表达对耻垢分枝杆菌生长无影响

为考察MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的表达是否影响耻垢分枝杆菌的生长特性，比较3种细菌的生长曲线，发现表达mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的耻垢分枝杆菌与携带pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌，均在15 h之后进入对数生长期，25 h达到平台期，三者生长特性没有明显差异(图8)。

图8 不同重组的耻垢分枝杆菌的生长曲线

五、Bdq对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌的敏感性降低

异烟肼对表达MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌及携带空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC均为1 μg/ml，表明异烟肼不是MmpS5-MmpL5蛋白外排系统的底物。Bdq对表达MmpL5蛋白及带有空质粒的耻垢分枝杆菌的MIC值为0.25 μg/ml，而对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌的MIC为2 μg/ml，MIC值提高了8倍。由此证明，MmpL5与MmpS5蛋白共表达才能发挥作用，且MmpS5-MmpL5蛋白的表达导致Bdq的耐药。

六、表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌外排能力增强

检测重组耻垢分枝杆菌对EtBr的积累，发现表达MmpL5蛋白与携带有pMV261s空质粒的耻垢分枝杆菌对EtBr的积累大致相同(△荧光强度值分别为655和642)，而表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌对EtBr的积累(△荧光强度值为395)较MmpL5组和pMV261s空质粒组减少约40%(表1)，说明MmpS5-MmpL5蛋白具有外排能力，而没有MmpS5的MmpL5蛋白不能形成外排泵。

表1 不同重组的耻垢分枝杆菌对溴化乙锭的积累影响

七、Bdq对表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌体内ATP含量影响较小

使用1/2 MIC浓度的Bdq作用24 h后，比较药物作用前后菌体内ATP含量的变化。Bdq作用前表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平[(0.193±0.028) μmol/L)]、表达MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平[(0.197±0.018) μmol/L]与携带pMV261s质粒组菌体ATP水平[(0.181±0.013) μmol/L]相比，差异无统计学意义(F=0.539，P=0.609)。Bdq作用后，表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平[(0.056±0.009) μmol/L]与pMV261s空质粒组菌体内ATP水平[(0.055±0.008) μmol/L]相比，差异无统计学意义(F=62.914，P=0.929)。药物作用后，表达MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌内ATP水平[(0.125±0.010) μmol/L]降低36.49%，而表达MmpL5蛋白组菌体ATP水平降低71.21%，空质粒组菌体ATP水平降低69.49%，表达MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平明显高于表达MmpL5蛋白组和空质粒组，差异有统计学意义(F=5.172，P=0.049)。这提示MmpS5与MmpL5蛋白作为复合体导致菌体外排Bdq能力增加，使Bdq作用于ATP合成酶的量减少，从而使菌体内ATP水平下降较少。

讨 论

外排泵能够将菌体内药物泵出，外排泵过表达使得菌体内药物浓度不能有效抑制分枝杆菌生长，是MTB耐药的重要原因之一。MmpL是分枝杆菌基因组编码的一组膜蛋白，属于外排泵RND蛋白超家族，在脂质、聚合物和免疫调节剂的运输过程中发挥重要作用[7]。笔者团队前期研究发现，Bdq和氯法齐明对Rv0678突变的MTB交叉耐药[6, 8-9]，Rv0678突变导致mmpL5和mmpS5表达的上调[5, 10]。近年研究表明，MmpS5-MmpL5系统也可以转运分枝菌素[11]。MTB编码13种MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白(Rv0676c基因编码)由964个氨基酸组成，理论相对分子质量为104 800，由12个跨膜结构域及2个周质结构域组成[12]。附属蛋白MmpS5(Rv0677c基因编码)由142个氨基酸组成，理论相对分子质量为15 200。mmpL5在转录上与mmpS5基因相偶联，二者位于同一操纵子内，受下游的转录抑制因子Rv0678的调控[13]。Andries 等[5]在MTB中单独过表达MmpS5蛋白没有改变Bdq对其的MIC值，提示单一的MmpS5蛋白对药物外排无影响，因此，本研究中没有单独构建MmpS5蛋白。

膜蛋白的表达与纯化一直是蛋白研究的技术难题，笔者课题组前期在BL21plys大肠杆菌及C43大肠杆菌中多次尝试表达膜蛋白MmpL5蛋白都未能获得理想结果，可能是外源膜蛋白在大肠杆菌中的毒性、错误折叠、聚集等导致表达量低。MTB的MmpL5与耻垢分枝杆菌同源MSMEG_1382的序列相似性为62.96%，表明MmpL5蛋白表达相应的条件在耻垢分枝杆菌可能具备。耻垢分枝杆菌无传染性和致病性，生长较快、操作较为容易[14]。这些特点都是耻垢分枝杆菌作为表达宿主菌的优势。乙酰胺酶启动子是一种强启动子，在耻垢分枝杆菌中受到严谨调控, 诱导后高水平表达[14]。Zhang等[15]利用乙酰胺酶启动子构建了MmpL3表达载体，成功实现了在耻垢分枝杆菌中表达和纯化。本研究通过改造pMV261穿梭载体，建立了带有组氨酸标签的乙酰胺诱导型表达载体pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5，蛋白免疫印迹验证了蛋白在耻垢分枝杆菌的成功表达。

本研究通过Bdq对3种重组菌株的药物敏感性试验发现，共表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌会降低Bdq对其的活性，而仅表达MmpL5蛋白的重组耻垢分枝杆菌对Bdq的药物敏感性无影响。这与Yamamoto 等[16]发现MmpS5促使MmpL5蛋白单聚体组装成三聚体发挥功能的结果一致。EtBr是一种荧光染料，是多数外排泵的转运底物，通常被用作测试药物外排泵活性的通用型底物[17]。重组耻垢分枝杆菌对EtBr的积累实验表明，MmpS5-MmpL5蛋白表达比MmpL5蛋白单独表达和空质粒组对EtBr的积累量较少，其外排能力增加。单独MmpL5蛋白表达与空质粒相比没有差异，进一步说明MmpS5和MmpL5蛋白共表达形成外排泵，发挥生物学功能。贝达喹啉的作用靶点是ATP合成酶，进而导致菌体内的ATP合成减少而发挥抗菌作用。为了考察Bdq通过MmpS5-MmpL5蛋白外排影响菌体内ATP水平，笔者在1/2 MIC浓度的Bdq作用下，发现共表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量较表达MmpL5蛋白和携带空质粒组变化小。结合MmpS5-MmpL5蛋白共表达导致的外排能力增强，表明MmpS5-MmpL5蛋白外排系统以Bdq为底物，通过增加Bdq的外排量使菌体内Bdq的含量降低，进而使Bdq抑制靶点ATP合成酶的量减少，导致菌体内ATP水平的变化较少。

综上所述，笔者构建了MTB的膜蛋白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5在耻垢分枝杆菌中的表达体系。功能实验也表明了MmpS5-MmpL5蛋白共表达形成外排泵发挥作用，降低Bdq的药物敏感性。本研究深化了对Bdq耐药机制的理解，而膜蛋白表达体系的建立为蛋白的纯化和进一步研究Bdq的转运机制奠定了基础。