基于网络药理学的中药组方“芩部丹”治疗肺结核作用机制研究

庄丽 马子风 蒋雨薇 黄星 张惠勇 鹿振辉 吴显伟

肺结核属中医学“肺痨”病症的范畴，是因痨虫侵袭肺脏，肺阴亏耗，肺络损伤所致的慢性肺系疾病，中医药在肺结核的认识与防治中具有独特的见解与优势。“芩部丹”由黄芩、百部、丹参组成，是上海市名老中医邵长荣教授创立的结核病经验组方。近年来，“芩部丹”及其复方治疗肺结核的临床与基础研究取得了一定进展，芩部丹片联合西药基础治疗方案治疗复治肺结核患者的病灶显著吸收率为67.7%，空洞闭合率为25.5%，优于单纯西医治疗[1]。难治性肺结核(经过初治、复治均未取得理想治疗效果的肺结核)患者服用芩部丹片的临床痰菌阴转率为34.5%[2]。芩部丹复方具有改善气阴两虚型耐多药肺结核患者临床症状和生存质量，促进痰菌阴转、空洞闭合的临床疗效[3-4]。中药复方治疗肺结核的临床疗效显著且安全可靠，具有多靶点、多层次的干预特点，但这也对中药复方的机制研究提出了较大的挑战。本研究借助网络药理学的研究理论与手段，从分子生物学角度对“芩部丹”治疗肺结核的作用机制进行初步探索，也为中药组方“芩部丹”的临床应用与研发提供一定的参考。

资料和方法

一、“芩部丹”组方活性成分的获取与靶点预测

选取《中药系统药理学数据库与分析平台》[5](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，简称“TCMSP数据库”；http：//tcmspw.com/tcmsp.php/)对“芩部丹”中的三味中药(黄芩、百部、丹参)所含有的化学成分进行查询，将口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为标准对所有成分进行筛选，以获得在人体中药代动力学较好的生物活性成分。进而汇总筛选得到药物成分，在TCMSP数据库中搜集药物活性成分对应的预测蛋白靶点，将结果导入到Uniprot平台(https://www.uniprot.org/)中替换成符合命名规范的基因靶点名称，以用于后续的研究与分析。

二、肺结核疾病靶点的获取

以“pulmonary tuberculosis”(肺结核)为关键词输入GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、OMIM(https://www.omim.org/)和TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库中查找肺结核的相关基因靶点。其中，对GeneCards数据库中的得分大于中位数的靶点予以保留，最终将多个靶点数据集进行整合，得到最终的肺结核疾病相关靶点。

三、“芩部丹”组方治疗肺结核的药物-成分-靶点网络构建及分析

将黄芩、百部、丹参活性成分的预测基因靶点进行汇总，去除重复项。对“芩部丹”与肺结核的基因靶点取交集，提交至在线作图平台(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)中绘制韦恩图。为了更加直观地了解“芩部丹”药物成分对肺结核疾病靶点的作用情况，将“芩部丹”治疗肺结核的基因靶点带入Cytoscape 3.7.1软件中完成药物-成分-靶点网络图的构建，根据介数中心性(betweenness centrality，BC)、紧密中心性(closeness centrality，CC)和连接度(Degree)的大小对各个节点的重要程度进行排序与筛选分析，得到“芩部丹”治疗肺结核的主要活性成分。

四、“芩部丹”组方治疗肺结核作用靶点的PPI网络构建

将“芩部丹”治疗肺结核疾病的靶点输入到STRING 11.0平台(https：//string-db.org/)建立预测靶点的蛋白互作(PPI)模型[6]。进而下载蛋白互作关系的数据表格，以Cytoscape 3.7.1软件为工具计算靶点的连线关系，通过计算BC、CC和Degree 值选取“芩部丹”治疗肺结核的核心靶点。

五、“芩部丹”组方治疗肺结核的靶点功能及通路分析

运用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在线数据库平台，获取GO功能及KEGG通路的富集分析，保留P值小于0.05的部分作为富集分析的结果，运用bioinformatics在线网站对结果进行可视化呈现。对KEGG 通路分析的结果进行文献检索与总结分析，筛选研究、报道中与肺结核相关的信号通路，对“芩部丹”在这些通路上的作用靶点以及相关联的活性成分进行汇总，采用Cytoscape 3.7.1 软件形成“芩部丹”治疗肺结核的靶点信号通路网络。

结 果

一、“芩部丹”组方主要活性成分及靶点

在TCMSP数据库中初步获取黄芩、百部、丹参的生物化学成分。经过对OB、DL值筛选并剔除无对应靶标的成分后，得到黄芩活性成分32个，百部活性成分28个，丹参活性成分59个，其中有3个中药成分为黄芩和百部共同含有的，分别为β-谷甾醇(β-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，共得到“芩部丹”组方的活性成分116个。进而借助TCMSP数据库对活性成分进行靶点预测，其中黄芩118个，百部104个，丹参134个，将三味中药对应靶点汇总去重，并对基因名称进行标准化处理，得到“芩部丹”组方的作用靶点共199个。

二、肺结核相关靶点的获取与筛选

GeneCard数据库中与肺结核相关的基因靶点共1712个，将所得靶点按得分进行排序后发现，最高值为79.963，最低值为0.163，保留大于2.712(中位数)的部分作为肺结核潜在靶点。在查找DrugBank、OMIM、TTD 数据库后另得到部分预测靶点，将4个数据库中获得的靶点去掉重复部分，共得到1409个与肺结核相关的基因靶点。

三、“芩部丹”组方治疗肺结核的药物-成分-靶点网络构建与主要成分分析

将整理得到的“芩部丹”组方与肺结核靶点取交集，从韦恩图中可知，“芩部丹”成分与肺结核的重合靶点有82个(图1)，表明“芩部丹”组方可能通过此82个靶点发挥治疗肺结核的作用。利用 Cytoscape 3.7.1软件构建“芩部丹”组方治疗肺结核的药物-成分-靶点网络(图2)。通过分析可以发现，此网络图中包含188个节点与612条连线，节点中包含3个中药名称，103个为药物成分，82个作用靶点。

注 左侧圆形代表肺结核涉及的相关靶点数量，右侧圆形代表“芩部丹”组方的预测治疗靶点数量，中间重叠部分代表“芩部丹”组方治疗肺结核的潜在靶点数量图1 “芩部丹”组方治疗肺结核的靶点韦恩图

注 HQ为黄芩药物及成分；BB为百部药物及成分；DS为丹参药物及成分；A1(β-谷甾醇)、A2(谷甾醇)、A3(豆甾醇)为黄芩与百部的共有成分，黄色部分为作用靶点图2 “芩部丹”组方治疗肺结核的药物-成分-靶点网络图

在“芩部丹”组方治疗肺结核的103个药物成分中，黄芩有30个，百部有22个，丹参有54个，其中黄芪与丹参有3个共有成分(表1)。在网络初步构建完成后进行拓扑学参数计算，结合BC、CC、Degree 对“芩部丹”的主要有效成分进行排序，选取三者的中位数(BC=0.0008，CC=0.3979，Degree=4)为划分标准筛选各药物节点，结果发现三者均大于中位数的成分为41个，有10个及以上作用靶点的成分为7个，分别为木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、黄芩素(baicalein)、刺槐素(acacetin)、刺芒柄花素(formononetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羟基-9,10-二氢菲(7-methoxy-3-methyl-2,5-dihydroxy-9,10-dihydrophenan-threne)，这些成分可能是“芩部丹”组方治疗肺结核的主要活性成分。

表1 “芩部丹”组方治疗肺结核的活性成分及网络标识

续表1

四、“芩部丹”组方治疗肺结核的蛋白互作(PPI)网络构建及核心靶点探索

将82个共同的靶点带入STRING 11.0平台中建立PPI网络(图3)，并运用Cytoscape 3.7.1软件得到此网络的拓扑学信息，BC、CC与Degree的中位数分别为0.0041、0.6231、32.5000，三者均大于中位数的基因靶点有32个，前20个靶点信息见表2。其中Degree值高于55的有10个靶点，可能为“芩部丹”治疗肺结核的核心靶点。

表2 “芩部丹”组方治疗肺结核的核心靶点及参数

图3 “芩部丹”组方治疗肺结核靶点的PPI网络图

五、“芩部丹”组方治疗肺结核作用靶点的功能及通路分析

基于DAVID 6.8数据库对“芩部丹”组方治疗肺结核的82个相关靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析(P值均<0.05)，并借助在线网络平台进行可视化作图处理。GO富集分析结果涉及到凋亡过程的负向调控(negative regulation of apoptotic process)、细胞增殖的正向调控(positive regulation of cell proliferation)、对药物产生的反应(response to drug)等373个生物学过程条目(图4)；细胞外空间(extracellular space)、细胞核(nucleus)、细胞质基质(cytosol)等39个细胞组分条目(图5)；酶结合(enzyme binding)、同蛋白结合(identical protein binding)、血红素结合(heme binding)等66个分子功能条目(图6)。通过KEGG富集分析与文献研究发现，“芩部丹”组方治疗肺结核获得108条信号通路，主要相关通路包含TNF信号通路(TNF signaling pathway；P<0.001)、细胞凋亡(apoptosis；P<0.001)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway；P<0.001)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway；P<0.001)、结核病(tuberculosis；P<0.001)，见图7；并构建前20条主要信号通路的靶点通路网络图(图8)。

图4 “芩部丹”组方治疗肺结核核心靶点的前20个生物学过程条目

图5 “芩部丹”组方治疗肺结核核心靶点的前20个细胞组分条目

图6 “芩部丹”组方治疗肺结核核心靶点的前20个分子功能条目

图7 “芩部丹”组方治疗肺结核核心靶点的前20条KEEG通路分析

讨 论

中医药在疾病防治中具有增强临床疗效、减少不良反应等特点，一直以来都是肺结核防治中不可或缺的重要治疗手段。但中药活性成分复杂多样，作用途径及靶点多种多样，通过单一的靶点与通路对中药复方的治疗机制进行阐释是不够全面的。

一、“芩部丹”组方的中医认识与现代药理研究

“芩部丹”组方的确立专为滋阴泻火、行瘀杀虫，主治肺结核。方中的黄芩长于清热、燥湿，入上焦以清肺泻火；百部为驱虫之常用药，擅于温润肺气、降气止咳。黄芩与百部相配伍能够起到滋阴泻火、润肺止咳之功效。但肺痨日久气血亏虚、血行不畅，导致瘀血内生，加入丹参可活血补血、凉血消痈。全方清泻祛瘀兼以补血，选药精炼却作用全面。现代药理研究也为黄芩、百部、丹参的临床应用提供了科学依据。黄芩能够解热、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫，百部可以祛痰镇咳、杀虫、抗菌、抗病毒等，两者在肺热咳嗽、哮喘、肺结核等呼吸系统病症的治疗中应用广泛[7-8]。丹参是临床常用的活血化瘀中药，具有增加冠脉流量、保护血管内皮与肾功能、抗肿瘤、抗氧化等功效，是治疗心脑血管疾病的重要药物[9]。丹参还能够抗炎，改善肺部缺氧，预防肺结核过程中的肺纤维化进展，在呼吸系统病症中的应用也得到了越来越多的关注[10-11]。

注 图中红色部分为作用靶点；绿色部分为信号通路图8 “芩部丹”组方治疗肺结核的前20条靶点通路网络图

二、“芩部丹”组方治疗肺结核的主要活性成分

虽然前期药理机制研究表明，“芩部丹”三味中药的单体成分(黄芩苷、对叶百部碱、丹参多酚酸盐)能够提高巨噬细胞表面TLR2受体的表达，可能通过调节机体免疫来发挥抗结核分枝杆菌的作用，且百部中的百部碱是能够增强THP-1(单核细胞白血病)细胞吞噬结核分枝杆菌能力的有效抗结核成分[12-13]。本研究中药物靶点网络的拓扑学分析指出，黄芩苷、对叶百部碱、百部碱、丹参多酚酸盐治疗肺结核的靶点较少，虽为治疗肺结核的重要明星成分，但根据本研究的结果尚不能将其列为“芩部丹”组方治疗肺结核的主要活性成分。本研究在构建药物-成分-靶点网络图后发现，“芩部丹”组方治疗肺结核的主要活性成分有木犀草素、汉黄芩素、黄芩素、刺槐素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羟基-9,10-二氢菲。

结核分枝杆菌侵袭机体后,多种免疫细胞被激活，释放大量炎症因子，导致肺部出现炎症损伤甚至组织破坏、空洞形成。研究表明，木犀草素是一种天然黄酮类化合物，可通过多种途径缓解炎症反应，并能减少肥大细胞释放白三烯，减轻急性肺损伤[14]，说明木犀草素可能具有改善肺结核患者的肺部炎症损伤的作用。黄芩素与汉黄芩素分别为黄芩苷和汉黄芩苷在体内水解后发挥作用的有效成分，具有抗炎、抗菌、调节免疫等作用[15-16]。黄芩素结合葡萄糖醛酸形成黄芩苷，能够调控巨噬细胞表面基因的表达，发挥抑制结核分枝杆菌生长的作用[17]。β-谷甾醇属于植物类固醇物质，是黄芩与百部的共有成分，能够调节外周血淋巴细胞和自然杀伤细胞的增殖与活化，减轻巨噬细胞、嗜酸性粒细胞介导的炎症反应，并有解热之功效，对结核分枝杆菌活性具有一定的抑制作用，是治疗肺结核以及免疫介导疾病的潜在有效成分[18-19]。刺槐素可以调节肺部巨噬细胞表面基因的表达水平来对抗炎症[20]。刺芒柄花素能够对脂多糖导致的小鼠急性肺损伤产生保护作用，改善肺部结构的病理损伤[21]。此外，7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羟基-9,10-二氢菲是百部的重要活性成分[22]，但目前尚无有关此成分治疗肺结核的报道，其治疗作用有待进一步研究与挖掘。“芩部丹”组方的多个主要活性成分与结核病的病理发展过程密切相关，也在一定程度上印证了本方治疗肺结核的临床有效性。

三、“芩部丹”组方治疗肺结核的核心靶点

通过成分-靶点的PPI网络图可以得知，“芩部丹”组方治疗肺结核的核心靶点主要有TP53、IL6、AKT1、VEGFA、EGFR、PTGS2、JUN、CASP3、STAT3、TNF。TP53可调控细胞周期停滞和凋亡，结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型上皮细胞的实验研究表明，p53(TP53的表达蛋白)的表达能够抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、Toll样受体-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)的活化，减少炎症因子的分泌，从而抵抗结核分枝杆菌的侵袭[23]。JUN可参与细胞凋亡、炎症、肿瘤产生等过程，AKT1可调控细胞的增殖生长，AKT1作为c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的一个上游调控因子，能作用于JNK，使其进入细胞核活化底物c-Jun，进一步促进细胞凋亡，降低结核分枝杆菌的生存能力[24]。白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是由T淋巴细胞与巨噬细胞分泌的重要促炎因子，STAT3为信号传导与转录激活因子，结核分枝杆菌产生的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)可活化巨噬细胞的STAT3，进一步刺激产生IL-6，促进炎症反应[25]。此外，EGFR为表皮生长因子受体，研究表明肺腺癌患者中有陈旧性肺结核者的EGFR突变率明显升高[26]。PTGS2是诱导型脂类调节物，在炎症介质影响下能够促进细胞凋亡，抑制血管生成[27]。CASP3 可调节肿瘤细胞的生长与增殖[28]。TNF可介导细胞的死亡、凋亡、炎症反应等过程，并能激活其他下游炎症因子，吸引炎症细胞向下呼吸道聚集[29]。这些基因介导了机体炎症反应、细胞凋亡与增殖等疾病进程，可能是“芩部丹”组方治疗肺结核的重要相关靶点。

四、“芩部丹”组方治疗肺结核的主要信号通路

本研究通过对筛选靶点的GO 富集分析发现，“芩部丹”组方治疗肺结核的生物学功能条目较多，主要在凋亡过程的负向调控、对药物的反应、细胞增殖的正向调控等方面。KEGG 通路富集分析的结果显示，“芩部丹”组方在肺结核的治疗中主要涉及到TNF信号通路、细胞凋亡、T细胞受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、结核病等。TNF信号通路是“芩部丹”组方与肺结核病理机制关系最为密切的通路，在调节体内炎症、免疫反应方面发挥着重要作用。TNF作为体内的重要促炎因子主要分为两类，TNF-α来自于活化的巨噬细胞，TNF-β来自于活化的淋巴细胞、自然杀伤细胞。相关研究指出，肺结核患者血清中的TNF-α与TNF-β水平显著升高，可促进组织损伤，但也能使巨噬细胞进一步活化并吞噬病菌，促使肉芽肿形成，使结核分枝杆菌处于相对静止稳定的状态[30]。该通路中富集的TNF、IL6、CASP3、AKT1、MAPK1、JUN、PTGS2等靶点同样是PPI分析中Degree值较高的靶点。此外，细胞凋亡也是“芩部丹”组方治疗肺结核的重要信号通路。肺部组织在受到结核分枝杆菌侵犯时，细胞启动凋亡机制，能够把结核分枝杆菌限制在凋亡细胞内，减少了病菌从感染的巨噬细胞向外扩散，并且凋亡通路还能发挥减轻炎症损伤的作用，是肺结核病变过程中机体的保护性过程[31]。该通路中富集的TP53、AKT1、TNF、CASP3、CYCS等靶点有较高的Degree值。调控TNF信号通路、细胞凋亡相关基因的表达可能是“芩部丹”治疗肺结核的重要机制，相关功能富集及信号通路的研究也为“芩部丹”组方的后续科研探索提供了一定的参考。

网络药理学以系统生物学为基础，并将药理学、计算机科学等知识融合，可以整合TCMSP、DrugBanK等多种功能强大的化合物及疾病靶点数据库，通过多层次的网络构建、拓扑学分析、通路富集，对复杂疾病的病理机制进行科学解释，并可对已知中药或中药复方治疗疾病的作用机制进行预测。本研究借助网络药理学方法对“芩部丹”组方的成分和靶点，以及肺结核相关疾病靶点进行筛选与关联，通过网络构建、通路富集与功能挖掘，揭示了中药组方“芩部丹”多靶点、多通路的抗肺结核作用机制，也将为“芩部丹”进一步的临床应用与研发提供更加丰富的参考与借鉴。