潜在性抗肿瘤和抗炎症靶点PARP14的研究进展

周 箭，黄贤华，张 进，卢小路，李 健

(1.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000；2.南昌大学基础医学院，江西 南昌 330031)

PARP14是聚(ADP-核糖)聚合酶的超家族中的一员，也被称为ARTD8、BAL2、pART8和COAST6，是一种细胞内单核(ADP-核糖)转移酶。PAPRs可将带负电荷的ADP-核糖从供体NAD+分子转移到它们的靶蛋白上，超家族成员中高度保守的催化结构域负责完成这个过程。为了稳定配体与受体间的结合、加强与家族其他成员的相互协调能力，PARPs在其催化位点含有1个供体环和1个受体环[1]。PARPs通过靶标蛋白的聚(ADP-核糖基)化(PARylation)，调控了广泛的体内生理过程，例如转录调控、应激反应、DNA修复、RNA剪切、线粒体功能、细胞分裂和核小体的形成等[2]。在目前已经发现的18个PARP超家族成员中，其家族成员之间的氨基酸序列同源性较低，它们的N-末端在结构域和功能上有明显的不同之处，包括调控模体、锌指结构和泛素化结合模体[3]，它们在不同疾病中发挥功能的方式和作用位点都不尽相同，因此对每个家族成员的研究都具有重要的意义。近年来科学家们对PARP14在疾病中的发挥作用的研究越发深入，PARP141在众多疾病中过表达使其成为一个极具潜力的药物靶点。此外，基于合成致死性理论及其在同源重组DNA修复中的独特作用，PARP14的抑制剂也可能成为一种潜在的DNA修复酶的增敏剂[3]。

1 PARP14的结构

PARP14是聚(ADP-核糖)聚合酶的超家族中分子量最大的成员，它含有1 801个氨基酸。PARP14由3个宏结构域(宏1、宏2和宏3)、1个WWE结构域和1个ARTD(或催化域)(如Fig 1，Fig 2)组成，还含有两个RNA识别模体(RRM)[4]。PARP14的宏结构域是ADP-核糖结合的部位，由7个β-折叠支撑，每边有2个或3个α-螺旋。催化域包含NAD+结合口袋，或称催化位点，它由“基”、“壁”和“盖”组成(如Fig 2F)。基部由β-折叠形成，并采用loop连接α-螺旋，壁由4个β-折叠和4个α-螺旋形成，盖子由α-螺旋和β-折叠之间的环形成(称为D-loop，氨基酸序列：1622-1626)。催化结构域中的结合残基包括：氢键结合残基Asp1604，芳香族残基Tyr1633和Tyr1646以及其他残基，如His1601、Gly1602、Thr1603、Ser1607、Ser1641和Thr1645。Tyr1620是催化中心外关键的芳香族残基。催化结构域内还有1个腺苷结合亚位点，关键腺苷亚位点的结合残基包括：氢键结合残基Ser1722，芳香族残基Tyr1727和Tyr1714以及其他残基，如Gly1683等。宏结构域1与ADP-核糖亲和力比较低，而宏结构域2和宏结构域3与ADP-核糖亲和力高，WWE结构域包含保守的色氨酸Trp和谷氨酸Glu残基，能够与ADP-核糖衍生物结合并稳定PARP14的结构[4]。

2 PARP14的生物学功能

PARP14主要分布在细胞核内，利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为底物，将1个NAD+分子切割成1个ADP-核糖和烟酰胺，然后将单个ADP-核糖转移到目标蛋白上完成对靶蛋白进行单ADP-核糖基化修饰，参与多种细胞反应和信号通路。PARP14作为一个控制基因转录的分子开关，从STAT6介导的IL-4依赖的基因转录激活开始，近年来，科学家们只发现了一个机制来说明PARP14在细胞信号通路中的关键作用(Fig 3)：首先，PARP14与STAT6形成复合物，促进IL-4依赖的基因发生转录，PARP14可以通过与STAT6的结合增强IL-4诱导的基因表达。在没有IL-4的情况下，PARP14最初结合组蛋白去乙酰化酶2和3(HDAC2和HDAC3)，以及IL-4应答启动子，以保持基因沉默。IL-4刺激后，STAT6被激活与靶基因结合，从而诱导PARP14的催化激活。活跃的PARP14在HDAC2、HDAC3和自身上完成单ADP-核糖基化，这使得PARP14和HDACs可以从对IL-4敏感的启动子中分离，然后与核受体共激活子1和3(NCoA1和NCoA3)和p300来结合形成复合物。接下来，组蛋白被乙酰化，这将启动一个特定的下游基因转录[3]，在这个过程中信号传感器(signal transducer)和转录激活因子6(activator of transcription 6，STAT6)在IL-4依赖的基因激活调控中起着关键的作用。PARP14最早是作为信号传递的转录辅因子及STAT6转录激活因子而被发现，PARP14可以激活酪氨酸激酶(JAK)介导的酪氨酸磷酸化(JAK/STAT)通路，最终激活STAT6[5-6]。PARP14作为转录共激活因子在细胞核内发挥功能，并为STAT6提供进入T-细胞的途径，使得STAT6能够与特异性转录因子(GATA3)启动子区域结合，在PARP14缺失的情况下，STAT6介导的信号通路明显受损[7]。PARP14还可介导JNK2信号通路和自分泌移动因子[(autocrine motility factor，AMF)又称葡萄糖异构酶(PGI)]形成复合物促使Th2免疫应答的过度激活，使得细胞进入厌氧状态，影响细胞代谢，激活细胞存活途径[8]，由此可见，PARP14在Th2细胞的分化中起着至关重要的作用。不仅如此，研究表明PARP14还促进了多个B细胞内与糖酵解和线粒体活性的相关基因的表达，PARP14是B细胞代谢适应、成熟和存活的关键蛋白[5]。PARP14对细胞内的代谢和生存基因的调控能促进Th2细胞内主要细胞因子IL-4、IL-13和IL-10的释放，进而促进了体液免疫应答[8]。IL-4对T细胞的内源性作用主要是通过激活JAK/STAT通路和增加自身的表达，有利于T细胞定向分化成Th2细胞[9]。IL-10和IL-13也可以激活有丝分裂原激活蛋白ERK1和ERK2的基因，PARP14促进IL-10和IL-13的释放间接促进细胞存活、分化和代谢[10]。

Fig 1 Schematic diagram of PARP14 domain architecture

Fig 2 Crystal structure of PARP14 domain parsed

Fig 3 Molecular mechanism of PARP14 regulating gene transcription

3 PARP14的过表达介导癌症的发生

PARP14在肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、胰腺癌(pancreatic carcinoma，PC)、人纤维肉瘤组织中高表达，其通过PARP14-JNK1-PKM2通路参与肿瘤细胞的增殖、分化等生物功能[11]。PARP14-JNK1-PKM2通路可通过Warburg效应(肿瘤细胞消耗的葡萄糖远远多于正常细胞，即使在氧气充足时，肿瘤细胞中葡萄糖不彻底氧化而是被分解生成乳酸)调节肿瘤细胞的代谢与凋亡等细胞生命活动[12-13]。肿瘤细胞中PARP14影响Warburg效应这一代谢特征已经成为肿瘤诊治新的依据和突破点。

PARP14的过表达是肿瘤产生的主要原因，PARP14介导的信号通路的过度激活最终导致原癌基因c-Myc的表达失控[5]，确切的说PARP14与肿瘤细胞的代谢调节之间存在某种必要联系，不难发现PARP家族的各个成员与细胞的联系都有不同之处，比如PARP5是通过介导Wnt信号通路与肿瘤细胞的联系起来的[14]。PARP14可以诱导丙酮酸激酶的亚基上的氨基酸残基Thr365的磷酸化导致PKM2的激活，然后通过PAPR14-JNK1-PKM2通路抑制促凋亡激酶(JNK1)依赖的丙酮酸激酶M2(PKM2)的激活和磷酸化来刺激癌细胞的增殖、生存、化疗敏感性和Warburg效应[15]。PARP14还有调节磷酸葡萄糖异构酶功能，即将磷酸葡萄糖异构为磷酸果糖，在糖酵解和有氧氧化过程中起着重要的作用。在肝癌患者的癌细胞中，明显观察到PARP14的过表达，与正常健康细胞相比，肝癌细胞中PARP14的表达水平升高数倍[11]。当PARP14蛋白的活性被抑制时，癌细胞的生长速度明显减慢，而正常细胞的生长速度没有受到影响[9]，这说明高选择性的PARP14抑制剂靶向作用于癌细胞而不是正常细胞，而且抑制PARP14的活性可以增强肝癌细胞对抗肝癌药物的敏感性[4]，这种定向杀死癌症细胞而不伤害正常细胞的治疗方法是最理想的治疗癌症的方法。

PARP14在骨髓瘤浆细胞中高表达，并且与骨髓瘤细胞生存所必需的JNK密切相关，PARP14的促生存功能依赖于JNK1介导的凋亡信号通路的抑制，JNK1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[15]。PARP14通过与JNK1结合从而抑制JNK1的功能促进骨髓瘤细胞的存活[16]，JNK2可以通过影响PARP14的表达来抑制JNK1介导的细胞凋亡[17]。PARP14在骨髓瘤细胞中的过表达不仅有利于骨髓瘤细胞的增殖，还帮助肿瘤细胞免于细胞凋亡。不仅如此，实验表明抑制PARP14还可增强MM细胞对抗骨髓瘤药物的敏感性[17]。同样，PARP14在人类原发性胰腺癌细胞中也发现了高表达的情况，体外和体内的功能性缺失实验发现敲除PARP14可导致PC细胞的凋亡增强、增殖抑制和对吉西他滨的化学敏感性增强，其分子机制可能是PARP14通过激活NF-κB信号通路来刺激PC进程[18]。

癌细胞内PARP14的过表达可以使癌细胞增强对葡萄糖的利用，促进癌细胞的生长，逆转细胞死亡的自然过程。研究表明，敲低PARP14可以导致癌细胞因饥饿而死亡。对癌症存活和死亡患者的肿瘤组织进行分析后，发现死亡的癌症患者的PARP14蛋白的表达量明显高于生存者[19]，我们可以通过观察肿瘤组织中的PARP14表达水平而预测患者的疾病恶性程度和生存情况。抑制PARP14的表达将会是未来一种非常有希望的癌症治疗方法，该方法不像传统的化疗和放疗会对健康组织有伤害，PARP14抑制剂只针对癌细胞[20]，这显示了PARP14抑制剂在抗癌治疗上的前景。综合来说，PARP14在肿瘤细胞中的作用为肿瘤细胞的治疗提供了一个很有效的治疗方向，PARP14将会成为一个非常有潜力的抗肿瘤靶点。

4 PARP14作为潜在的抗炎和抗病毒的靶点

PARP14可以促进Th2细胞分化，从而影响炎症反应和免疫调节等生理状态，许多炎症性疾病例如嗜酸性食管炎、过敏性皮炎、哮喘相关的气道高反应性表型和食物过敏等，均表现出STAT6的过度激活和Th2细胞因子的升高[4]，而PARP14能够促进STAT6的激活。研究表明，转基因小鼠的模型中抑制PAPR14可以减轻肺局部炎症反应，恢复肺功能[21]。PARP14与嗜酸粒细胞活化趋化因子-3(CCL26)的表达呈正相关，激活PARP14时嗜酸性食管炎中观察到嗜酸性粒细胞浸润增加，抑制PARP14可以降低CCL26的表达[22]。PARP14在STAT6介导的Th2激活和Th2细胞因子释放中起着关键作用。而在其他疾病如急性动脉病变和慢性动脉粥样硬化中也可以观察到类似的结果，研究表明PARP14缺失促进了巨噬细胞的激活和病变的发展，在造血系中的PARP14对动脉疾病具有保护作用[23]。该发现为PARP14参与的巨噬细胞激活的新机制提供了见解。

研究表明，PARP14可能在对抗SARS-CoV-2病毒中发挥着激活免疫系统的功能，很多病毒中都具有ADP-核糖基水解酶活性的宏结构域，包括SARS-CoV-2冠状病毒[24]。研究发现用选择性PARP14的催化结构域抑制剂治疗原热带冠状病毒，观察到整体干扰素总量的下降，这表明PARP14的抗病毒活性取决于其催化结构域。最新研究表明，可用IFN-1作为病毒感染的候选治疗，而PARP14对IFN-1的产生作用显示了其在对抗SARS-CoV-2的免疫应答中的重要性[25]，PARP14可能会成为对抗SARS-CoV-2的重要靶点。

5 PARP14抑制剂与降解剂

近几年人们对PARP14的结构和功能不断进行深入探索，并对PARP14的抑制剂展开了大量的研究。已知的大部分的PARP抑制剂都是烟酰胺类似物，作为竞争性抑制剂结合在催化结构域的NAD+结合口袋中[37]。研究表明包括PARP14在内的PARPs蛋白有很好的非选择性抑制效果，并且发现它们与Tyr1633、Tyr1624、Tyr1640和Tyr1646残基以及Ser1641和Gly1602的残基之间存在的氢键作用力和疏水相互作用，从而降低其生物活性[26]。目前，在PDB中公布了57个PARP14不同结构域与小分子抑制剂的复合物晶体结构(Tab 1)，结构域包括Macro domain 1、Macro domain 2、Macro domain 3和Catalytic domain，部分配体和结构域结合的复合物晶型中观察到不仅一个分子，还有甘油、二甲基亚砜和氯离子[3]。但是目前这些小分子抑制剂的发现并没有很好的用于成药设计，主要目的是为了解析PARP14的晶型结构和设计出新的合成思路。研发出更有效的靶向PARP14小分子抑制剂是目前非常热门的方向，比如GeA-69、RBN012759、咔唑108、H10(Fig 4)等一些小分子化合物在抑制剂的发展过程中占有重要地位。实验研究表明，RBN012759是一种有效的、选择性的PARP14抑制剂，对人类和小鼠的IC50值分别为IC50<3 nmol·L-1和IC50<5 nmol·L-1，比对mono-PARPs的选择性高300倍，比对poly-PARPs的选择性高1 000倍，并且临床试验表明RBN012759可以降低肿瘤前巨噬细胞的功能并引起肿瘤外植体的炎症反应[27]。GeA-69是一种选择性的、高细胞渗透性的PARP14变构抑制剂，靶向作用于宏结构域2(MD2)，Kd值为2。1 μ mol·L-1，表现出对PARP14宏结构域2的亚微摩尔抑制作用。咔唑108是以GeA-69为先导化合物扩展出甲磺酰胺基序，表现出较GeA-69对PARP14宏域2更优的亚微摩尔抑制[28]。H10是针对PARP14的选择性抑制剂(IC50=490 nmol·L-1)，其对PARP14的选择性是PARP1的24倍[29]。在抑制剂中，选择性的PARP14抑制剂通常有良好的水溶性，这是一个非常有利于抑制剂研发的突破口。此外，PARP14的宏结构域2和3已被证明对ADP-核糖结合力具有明显的选择性，表明这些结构域可能是选择性抑制的潜在结合位点。基于以上信息，研究人员可以设计骨架新颖、高选择性的小分子抑制剂，靶向PARP14的催化结构域或宏结构域，以抑制其功能。此外，研究发现一些小分子抑制剂的结构修饰后不仅能够抑制PARP14的功能，并且能够促进PARP14泛素化反应使得其被降解，例如小分子RBN012811，是以高选择性的小分子抑制剂RBN012042(PDB ID:7L9Y)为母核，并用连接体与沙利度胺连接的小分子(Fig 5)，RBN012811保留了RBN012042对PARP14的高选择性，其选择性大约是其他PARP的200倍，这直接影响着RBN012811在人体内的作用靶点，实验表明RBN012811对其他的PARP几乎没有降解作用[30]。像RBN012811这种对PARP14即有较强的抑制作用(IC50=10 nmol·L-1)并且能够诱导泛素-蛋白酶体系统降解掉PARP14的小分子被称为双功能的降解剂，双功能降解剂的发现使得对PARP14抑制剂的探索的这项研究达到了一个更高的层次[30]。

（1）全面做好前期性的水利施工预备。从前期开展的各项施工预备角度来讲，关键在于筹备当前水利施工必需的各类物资、人力资源以及施工资金等，确保做好妥善的前期施工预备。与此同时，技术人员有必要给出相应的水利设计图纸，并且拟定可行性较强的水利施工规划。针对各类必需的施工设备来讲，应当做好妥善性的设备养护以及设备检测。在此前提下，关于各类建材也要做好综合性的收管工作以及采购审核工作，确保能够录入详细性的产品资料与产品信息数据。

在唐传奇中，常常涉及鬼怪神魔，而这些异时空的生物，在白天往往只是偶然现身于人们的生活，到了夜禁开始之后，街道上空无一人，白昼的花花世界此时便为这些“神鬼所占据。

6 展望

目前的研究表明，PARP14将成为多种疾病的治疗中极具潜力的药物靶点，其中癌症、病毒感染等是目前研究的热门方向。关于PARP14抑制剂研究进展表明，尽管目前还没有确凿的证据表明高度选择性的PARP14抑制剂对治疗上述的疾病都有利，但是催化结构域的序列同源性很低，以及宏结构域的亲和力不同，使得发现与优化获得靶向PARP14具有高选择性、高亲和力的抑制剂成为可能。抑制并降解PARP14在治疗上很有吸引力，但仍需要药理学改进的化合物或与其他疗法的组合以发挥抗癌作用。PARP14抑制剂可能需与其他的调控细胞途径的关键酶抑制剂合用来提高治疗效果。因此，与其他PARP选择性抑制剂联用也是未来的重要探索方向，不仅如此，双功能PARP14降解剂的发现给我们的研发提供了一个新的研究思路。开发更有效和更具特异性的PARP14降解剂不仅能够使我们进一步深入认识PARP14的功能，更重要的是推动肿瘤治疗相关的临床研究。

Fig 4 Chemical structure of small molecule inhibitors

Fig 5 Design of PARP14 depressant RBN012811

Tab 1 Ligand,crystal structure of PARP14 in PDB