稳定表达小反刍兽疫病毒衣壳蛋白的Vero细胞系的筛选和鉴定

贾雪霞，刘 莹,3，孟德梅，樊振川

（1.天津科技大学食品科学与工程学院 省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学 大健康生物技术研究所，天津 300457；3.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

小反刍兽疫（peste des petits ruminants, PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants,PPRV）引起的一类急性接触性传染病，在山羊、绵羊及野生小反刍动物中广泛流传，以发热、腹泻、肺炎为主要发病特征[1]。PPRV通过呼吸途径传播，具有很强的传染性，尤其在发展中国家家养和野生小反刍动物中传播，且会引起严重的免疫抑制[2-3]，造成巨大经济损失。由于病毒传播广泛，幼兽的死亡率高，因此，PPR被世界动物卫生组织（Office international des epizooties, OIE）列为烈性传染病，并计划在2030年全球范围内消灭PPRV[4]。在我国，PPRV因其危害程度高，被列为A类传染病。

PPRV属于副粘病毒科麻疹病毒属，编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白，结构蛋白包括衣壳蛋白（N）、病毒RNA依赖性聚合酶（L）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）和血凝素蛋白（H）[5]。N蛋白为病毒的核衣壳蛋白，保护RNA免受RNA酶的降解。N蛋白在病毒复制和转录中起着核心作用，与P蛋白和L蛋白协同作用，帮助病毒繁殖，形成完整的病毒粒子[6-7]。此外，N蛋白在PPRV中含量最高、免疫原性最强，具有重要的诊断意义[8]。

与其他单股负链无节段RNA病毒一样，PPRV的基因组不能直接在细胞内进行复制和转录，它需要核糖核蛋白复合物（RNP）的辅助[9]。RNP包括N蛋白、P蛋白以及L蛋白，其中N蛋白作为病毒的核衣壳在转录和复制中起着关键的作用[10]。早在90年代，研究者就开始利用人胚肾细胞（HEK293）构建能够稳定表达麻疹病毒N蛋白、P蛋白的稳定细胞系来辅助拯救完整的病毒粒子[11]。Ismail等[10]在1995年利用能够表达小反刍兽疫N蛋白的重组病毒侵染昆虫细胞用于血清学诊断。之后，不断有研究者对N蛋白的表达进行了研究，Zhang等[12]人工合成了PPRV N基因并且在大肠杆菌中进行了原核表达且产量较高。Basagoudanavar等[13]在PPRV N基因末端添加了6×His标签，与杆状病毒重组后，通过昆虫细胞sf-21进行了放大和表达，最终通过Western blot直观得出较高纯度的衣壳蛋白。

本实验室改进了细胞转染的方法，通过电穿孔转染的方式将PPRV N基因转染进Vero细胞，并利用G418抗生素加压进行筛选，最终得到了稳定且表达量高的PPRV衣壳蛋白稳定细胞系，可为PPR疫情的诊断及新型疫苗的构建提供高质量蛋白。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 含有PPRV N基因的重组质粒pBad24和PcDNA3.1真核表达载体（对多克隆位点进行了改造）以及Vero细胞由本实验室保存。

1.2 试剂 限制性内切酶KpnⅠ、EcoRⅠ购自NEB公司；pfu DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Thermo公司；质粒提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒和高效RIPA裂解液购自索莱宝公司；HA-Tag多克隆抗体（mAb）、蛋白预染Marker和G418购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG mAb购自Sigma公司；DMEM（H）培养基和胰酶购自Gbico公司；胎牛血清购自CellMax公司。

1.3 pcDNA3.1-pN重组质粒的构建 根据GenBank中PPRV Nigeria75/1株基因序列（GenBank登录号：HQ197753）设计编码N蛋白基因的特异性扩增引物，在上游和下游引物5'端分别添加KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点（Kpn I-pN-F：5′-GGCGGTACCGCCA CCGGGAGAGGAGGAGGAGCAAGA-3′；EcoR I-HA-pN-R：5′-CGGAATTCTTAAGCGTAATCT GGAACATCGTATGGGTAGCTGAGGAGATCCTT GTCGTTGT-3′）。以含有N基因的pBad24质粒为模版，使用上述引物，进行PCR扩增，扩增反应程序为：95℃预变性8 min；9 5℃变性90 s，55 ℃退火45 s，72℃引物延伸90 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。随后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后，用KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切，克隆至pcDNA3.1载体中，构建带有HA标签的重组质粒pcDNA3.1-pN。构建策略如图1所示，并经过双酶切验证和测序验证，结果表明重组载体构建成功。

图1 重组质粒载体pc DNA3.1-pN的构建Fig.1 Construction of pcDNA3.1-pN recombinant plasmid

1.4 表达PPRV N蛋白细胞系的建立及筛选 在T175细胞培养瓶中栽种2×106个Vero细胞，当细胞铺满底部时，胰酶消化吹散成单个细胞，预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）洗涤3次，调整细胞浓度为1～2×107个/mL，取400 μL细胞悬液于1.5 mL离心管中，与4 μg pcDNA3.1-pN质粒混合后，转移至4 mm无菌电转杯中进行电转，电转参数为：800 V，25 μF，∞，4 mm，电击两次。之后，将细胞悬液转移至10个含有10 mL完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM（H）培养基）的90 mm2细胞培养皿中，待细胞恢复贴壁状态后，加入细胞筛选药物G418，其浓度经过最佳浓度筛选后确定为400 μg/mL。挑选在G418压力下能正常生长的细胞，通过Western blot筛选能正确表达N蛋白的细胞株并进行保存。命名为Vero-PPRV-N+编号。

1.5 Vero-PPRV-N细胞系传代稳定性检测 将Vero-PPRV-N系列细胞株在G418压力下常规传代，在传至10代后再次进行Western blot检测，将表达量最高的细胞株进行扩增保存，为最终筛选成功的细胞株。

1.6 Western blot 首先进行样品制备，取1.5 mL细胞样品，PBS（0.01mol/L，pH 7.4）洗涤两次，加入50 L高效细胞裂解液吹吸均匀，静置20 min，离心取上清液备用；然后进行SDS-PAGE电泳（每个样品点样量均为20 μg），结束后于40 V电压下转膜至硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂乳粉室温封闭1 h；随后按照1∶1000比例加入鼠抗HA抗体5 mL，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，再按照1∶10000比例加入HRP偶联的兔抗鼠IgG 5 mL，室温孵育1 h，用TBST洗膜3次后，最后用化学发光显色试剂盒显色。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-pN重组质粒的构建及鉴定 将PCR扩增的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，在1693 bp处得到一条亮带；将目的基因与载体连接后转入E. coli XL1-blue中，转化子经双酶切后得到大小正确的目的片段及载体。此外，测序后与原序列相比，大小、碱基正确，并且在3'端引入了HA标签序列，说明重组载体pcDNA3.1-pN构建成功。

2.2 G418最佳浓度筛选 选取200、400、600、800 μg/mL的G418浓度进行实验，并以不加G418的细胞作为对照，筛选10～14 d能够把Vero细胞全部杀死的最低浓度，最终选定400 μg/mL作为最佳浓度（图2）。

图2 G418最佳加压浓度优化Fig.2 The optimum pressure concentration for G418

2.3 Vero-PPRV-N 细胞系的初筛 加压培养的细胞铺满6孔板后，细胞破碎，ELISA测定总蛋白浓度，将20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，Western blot检测PPRV N蛋白的表达（图4）。根据 N蛋白的大小为54 kDa，最终初筛出1#、9#、12#三株细胞株。

图4 稳定细胞系初筛P10代Western blot结果Fig.4 Result of the P10 stable cell line screened by Western blot

2.4 Vero-PPRV-N稳定细胞系的终筛 将细胞加压传10代后，再次进行Western blot检测，总蛋白浓度定量20 μg，由图5可看出9号细胞株在进行了10 次传代后，仍能稳定的高表达N蛋白，因此选择9#细胞株作为最终筛选的稳定细胞系。

图3 稳定细胞系初筛P0代We stern blot结果Fig.3 Western blot result of the P0 stable cell line screened

3 讨论

小反刍兽疫疫情的早期诊断，对于疫情的控制具有重要意义。N蛋白作为病毒粒子中含量最高的结构蛋白，具有免疫原性强的特点，在疫苗免疫中易 产生针对N蛋白的抗体，对于疫情的诊断与鉴定十分重要。Zhang等[12]在大肠杆菌成功表达PPRV N基因，纯化后与PPRV N蛋白单克隆抗体结合，建立了一种间接ELISA方法，检测血清中的PPRV抗体。之后他们又合成了PPRV N蛋白表位肽，免疫家兔后得到抗体效价较高的抗体，制备出检测PPRV感染的cELISA试剂盒，灵敏度和特异性均超过了90%[14]。然而原核表达的N蛋白及化学合成的N蛋白，由于翻译后的修饰不全等原因与天然的N蛋白在结构上有所差异，使得在利用N蛋白对病毒检测的过程中出现不能准确地识别N蛋白免疫位点的情况[12]。大量文献报道，通过稳定细胞系真核表达得到的蛋白，其空间结构更接近天然结构，可作为诊断及鉴定的优质抗原蛋白来源[15-16]。李翠翠等[17]利用转染试剂成功将N蛋白转入CHO细胞，构建了稳定表达N蛋白的细胞系，但最终表达量较低。此外，BHK21、HEK293和CHO细胞都曾作为辅助细胞，用于稳定细胞系的建立[17-19]。相比较之前的研究，我们本次稳定细胞系构建使用的Vero细胞，由于基因组缺陷，不能表达抗病毒蛋白干扰素，且该细胞易培养，传代代次长，遗传性状稳定，无外源性污染，具有更好的生物安全特性[20]，已经被广泛应用于病毒疫苗的生产。此外，本研究在PPRV N基因末端添加的HA标签，只有9个氨基酸，具有对目标蛋白空间结构影响小，容易融合到N端和C端等优点[21]，相对于常用的His标签，可使Western blot结果的背景更加干净，无杂带。

目前小反刍兽疫的免疫主要使用弱毒疫苗株，其缺点是无法从血清学上区分自然感染PPRV野毒株的动物和疫苗株免疫的动物，给大范围内进行血清学调查带来了困难[1,22]。反向遗传学的发展使得基因标记疫苗的研究得到了飞速发展[23-25]，其中N蛋白作为负链RNA病毒复制必需的蛋白，在病毒繁殖过程中起着重要的作用。殷倩倩等[26]将感染性克隆质粒与N蛋白质粒共转染进Vero细胞，获得了重组PPRV病毒，免疫荧光试验表明N蛋白表达正确，但表达量不高。本 实验构建的Vero稳定细胞系N蛋白表达量高，可作为稳定的N蛋白来源参与病毒的复制，在构建感染性克隆中减少因瞬时转染产生的转染率不高及蛋白表达量不稳定等不确定因素，且可用来构建缺失病毒衣壳蛋白的一次性侵染感染性克隆，为小反刍兽疫基因标记疫苗的研究奠定了基础。