猪源MHCⅡ类分子反式激活因子CIITA SYBR GreenΙ荧光定量PCR检测方法的建立

朱豪杰，高 飞，李丽薇，虞凌雪，张玉娇，张 宽，童光志，姜一峰，李国新,2

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

MHC Ⅱ（major histocompatibility complex class II）类分子作为诱导CD4+T细胞发育和活化的关键因子[1-2]， 在适应性免疫反应中发挥着重要作用。MHCⅡ类分子功能的实现需要其编码基因按照严格的细胞特异性和定量调控模式进行转录调控，这个复杂的基因表达谱几乎全由一个主调控因子控制，被称为Ⅱ类反激活因子-CIITA[3-5]。CIITA主序列的重要特征为：氨基（N）末端区域富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸等三个酸性氨基酸，中心区域为GTP结合结构域，羧基（C）-末端由富含亮氨酸的重复序列（LRRs）组成[5]。它通过多种机制参与促进转录：第一，招募转录因子IID（TFIID）和一般转录启动机制的TFIIB[6-7]；第二，诱导RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化[8]；第三，与阳性转录延长因子b（P-TEFb）相互作用[9]；第四，招募通过诱导组蛋白乙酰化或甲基化来改变染色质可及性的辅激活剂[10]；第五，招募色素重构因子BRAHMA相关基因1（BRG1）[11]。多种病原体可通过对CIITA基因的干扰来逃避机体的免疫反应，例如HIV的转录激活蛋白通过与细胞周期蛋白T1结合，干扰CIITA的功能，以此来阻止MHCⅡ类基因在HIV感染中的表达[9]；结核分枝杆菌通过产生19 kDa的脂蛋白来抑制CIITA的功能，达到逃避机体免疫反应的目的[12]。

本试验通对猪源CIITA基因的克隆，成功构建了pCold-TF-CIITA质粒，并建立了CIITA基因的SYBR Green Ι实时荧光定量PCR方法，该方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好，为进一步研究病原微生物在感染过程中的免疫逃逸机制提供了准确、有效的工具。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大肠杆菌Top10购自天根生化科技有限公司；pCold-TF载体由实验室保存；同源重组酶Exnase Ⅱ、SYBR qPCR Master Mix均购自Vazyme公司；PCR反应所用的相5×PrimeScript RT Master、Prime STAR HS DNA、2×GC buffer、dNTP均购自TaKaRa公司；EcoRⅠ-HF和CutSmart buffer购自BioLabs公司；Total RNA KitΙ试剂盒购自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购自MACHEREYNAGEL公司；Thermo Scientific Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒、Nanodrop2000分光光度计购自赛默飞生物科技有限公司；LightCycler480购自Roche公司。

1.2 引物设计与合成 参照GenBank登录的CIITA基因组CDS区域序列，应用CE Design V1.02设计扩增PCR引物，用Primei-Blast设计RT-PCR引物（表1），引物由上海派森诺基因科技有限公司合成。扩增引物两端插入EcoRⅠ酶切位点。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 阳性标准品的制备

1.3.1 标准质粒的构建 采用肺泡灌洗法获得猪肺泡巨噬（Porcine alveolar macrophage, PAM）[13]，按照Total RNA Kit Ι试剂盒说明书提取出细胞总RNA，以总RNA为模版，反转录体系按照Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作合成cDNA。用表1设计的常规PCR引物进行PCR扩增，反应体系为：2×GC buffer 25 μL，引物CIITA-F和CIITA-R各0.5 μL，dNTP 4 μL，基因组模板2 μL，酶0.5 μL，ddH2O补至50 μL。反应条件为： 95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸7 min。扩增产物按照胶回收试剂盒说明纯化后连接到pCold-TF载体上，将重组质粒转化至Top10感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平皿上培养12 h，挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12 h后提取质粒，用EcoRⅠ-HF内切酶酶切鉴定后送上海派森诺基因科技有限公司测序。将测序正确的质粒命名为pCold-TF-CIITA，作为定量PCR的标准品质粒。

1.3.2 标准质粒浓度测定 将获得的标准质粒使用Nanodrop2000分光光度计进行浓度测定，根据公示计算：拷贝数（copies/μL）=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（660×碱基数），然后将标准质粒进行10倍梯度稀释，选取7个稀释度的质粒作为标准品，用于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的检测。

1.4 标准曲线的建立 以不同浓度的标准质粒为模板，进行实时荧光定量PCR，反应结束，软件自动生成溶解曲线。以标准质粒起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制出建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线。根据结果，对荧光定量PCR方法的最佳反应条件进行优化。

1.5 特异性检测 以优化的反应条件分别检测CIITA标准质粒、猪肺泡巨噬细胞（PAM）、人肾上皮细胞（293T）、羊子宫内膜细胞（endometrial cell，EEC）、非洲绿猴肾细胞（Marc- 145）的cDNA，以评估建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。

1.6 敏感性试验 将pCold-TF-CIITA质粒标准品进行连续稀释，用建立的SYBR GreenΙ荧光定量PCR方法进行检测，通过对结果的分析和计算，计算出该方法可以检测的最低检测量。同时，利用普通PCR对稀释后的质粒标准品进行检测，对建立的SYBR GreenΙ荧光定量PCR方法和普通PCR方法的敏感性进行比较。

1.7 重复性试验 将pCold-TF-CIITA质粒标准品按照1.68×101～1.68×107copies/μL进行10倍梯度稀释，用建立的SYBR GreenΙ荧光定量PCR方法分别对样品进行检测，记录Ct值。组内重复性是将每个浓度的样品进行3次重复检验，求出平均值、标准差和变异系数。组间重复性是用相同的方法间隔一天检测同一样品，共检测3次，求出平均值、标准差和变异系数。

1.8 接毒细胞样品检测 从实验室制备的PAM细胞上接毒样品6份，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，反转录后用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 目的基因扩增及标准质粒的构建 对PAM细胞提总RNA，反转录获得cDNA，用设计的特异性引物对CIITA基因进行PCR扩增，成功扩增出1700 bp左右的目的基因片段（图1），胶回收后与载体进行连接，命名为pCold-TF-CIITA。对重组质粒多克隆位点区域进行测序分析，结果显示扩增的目的基因与GenBank登录的序列同源性为100%，表明质粒构建成功。

图1 CIITA基因的PCR扩增结果Fig.1 Amplification results of CIITA gene by PCR

2.2 标准曲线绘制及溶解曲线分析 使用分光光度计进行浓度测定，并计算标准质粒初始拷贝数为1.68×1011copies/μL。取1.68×101～1.68×107copies/μL共7个稀释度的重组质粒作为模板，分别加入到荧光定量PCR反应体系中进行扩增，获得CIITA基因荧光定量PCR动力学曲线。根据结果继续优化反应条件，最终确定PCR反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s。按照优化后的反应条件对标准品进行扩增，结果根据动力学曲线测得其斜率为-3.3732，截距为35.049，相关系数R2=0.9989，扩增效率为97.9%（图2、图3），符合试验预期。对不同稀释度标准质粒PCR扩增产物进行溶解温度分析，结果显示标准质粒各个稀释度的溶解温度均为86.08℃～86.15℃（图4），波峰高度与质粒浓度呈正相关。

图2 CIITA SYBR G reenⅠ实时荧光PCR扩增曲线Fig.2 Amplification curve of SYBR GreenⅠreal-time PCR

图3 SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法标准曲线Fig.3 Standard curve of SYBR GreenⅠreal-time PCR

图4 SYBR GreenⅠ实时荧光PCR溶解曲线Fig.4 Melting curve of SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.3 敏感性试验 将提取标准质粒计算拷贝数，进行10倍倍比稀释作为模板进行荧光定量PCR扩增，结果显示荧光定量PCR能检测出最大稀释度拷贝数为16.8 copies/μL，而常规PCR检测出最大稀释度拷贝数为1.68×103copies/μL，本试验所建立的荧光定量PCR敏感性是常规PCR的100倍（图2、图5）。

图5 PCR方法的敏感性试验Fig.5 Sens itivity test of PCR

2.4 特异性试验 对不同来源细胞 的cDNA进行扩增，结果显示只有CIITA质粒和PAM细胞有荧光信号，293T细胞、EEC细胞、Marc-145细胞及阴性对照均无荧光信号，表明该方法有很好的特异性（图6）。

图6 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 方法的特异性试验Fig.6 Specificity test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.5 重复性检测 将不同稀释浓度的标准品进行SYBR G r e e nⅠ荧光定量P C R，结果表明，建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR组内变异系数为0.052%～0.878%，组间变异系数为0.075%～0.688%，组内和组间变异系数均小于 1%（图7，表2）。

表2 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的重复性试验Table 2 The reproducibility test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

图7 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR重复性试验Fig.7 Reproducibility test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.6 接毒细胞样品检测 对实验室保存的6份接毒后的PAM细胞样品进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测，结果显示猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染PAM后能够显著降低CIITA的转录水平，且CIITA的相对表达量与接毒的时间呈负相关（图8，图9）。

图8 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR接毒细胞样品检测试验结果Fig.8 Clinical sample test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

图9 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR接毒细胞样品检测试验Fig.9 Virus-inoculted cell sample test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

3 讨论

在过去的十年里，对调节MHC Ⅱ类分子编码基因转录的分子机制研究突飞猛进，而CIITA作为MHC Ⅱ类表达的主调控因子的作用，更是激发了人们对控制其表达的分子机制的大量兴趣。研究表明，病原微生物可利用各种策略对CIITA进行干扰，从而逃避宿主的保护性免疫反应，例如HIV的转录转激活蛋白就可通过竞争一种转录延伸因子P-TEFb，从而干扰CIITA 的功能[9]；人类巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、人类副流感病毒3型均可通过诱导IFN-γ来调控CIITA的表达,从而躲避机体的免疫调节[14-17]。目前国内有关猪源CIITA基因的分子检测技术报道相对较少，传统的RT-PCR方法虽然能检测出CIITA基因的存在，但因为其灵敏度有限，同时也不能对拷贝数进行准确的定量。荧光定量PCR与常规PCR相比，不仅实现了从传统PCR的定性到定量的飞跃，而且具有简便易行、灵敏度高、特异性强等优点[18]。荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green法和TaqMan水解探针法，前者虽然检测特异性较后者低，但检测成本低廉，具有很好的实用性。

本试验建立的猪源CIITA基因SYBR GreenΙ荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，能够特异性地对猪源CIITA基因进行检测，与其他物种无交叉反应，检测的下限为16.8 copies/μL，敏感性是常规PCR的100倍。重复性好，组内变异系数为0.052%～0.878%，组间变异系数为0.075%～0.688%，组内和组间变异系数均小于1%。应用建立的实时荧光定量PCR方法，对接毒细胞样品进行检测，结果显示PRRSV感染后能够显著降低CIITA基因的转录水平，符合预期。本试验建立的猪源CIITA基因SYBR Green Ι荧光定量PCR方法能够快速有效地对CIITA基因进行定量检测，为进一步研究病原微生物免疫逃逸机制提供了工具。