鸡毒支原体VLHA3.03蛋白的原核表达及免疫原性分析

陈玥彤，祁晶晶，胡增金,3，赵宇馨，李浩然,3，刘晓涵，王少辉，田明星，郭 伶，于圣青，周铁忠

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，锦州 121000；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）是鸡慢性呼吸道疾病和火鸡传染性鼻窦炎的病原[1]，受感染的鸡会出现流鼻涕、面部肿胀、咳嗽，严重时张口呼吸或呼吸困难，有的可明显地听到湿啰音[2]。它最初引起上呼吸道和中呼吸道的炎症，导致气管炎，可能延伸到支气管、肺脏和气囊。因MG会侵害动物体呼吸道使其抵抗力降低，所以该菌容易和大肠杆菌（E. coli）、鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）等混合或继发感染，从而导致病情更加严重[3]。

目前MG、滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）、牛支原体和人型支原体的表面可变蛋白均被报道与支原体的细胞黏附有关，牛支原体的表面可变脂蛋白（variable surface lipoprotein, VSP）已被证实为牛支原体的黏附因子[4]。胡永婷等[5]利用间接免疫荧光和微孔板黏附试验验证了猪鼻支原体表面可变脂蛋白（variable lipoprotein, VLP）在黏附宿主细胞中也起着重要作用。MG和MS的可变脂蛋白血凝素（variable lipoprotein and hemagglutinin, VLHA）与牛支原体的VSP类似，也是一种可变表面脂蛋白，被证实能使MG或MS黏附至宿主细胞受体上发挥致病作用[6-7]。胡娟[8]以原核表达的牛支原体VSP重复片段蛋白作为包被抗原，成功建立了牛支原体间ELISA抗体检测方法。王佳等[9]将猪鼻支原体的VSP的特定肽段作为包被抗原，成功建立了检测猪鼻支原体血清抗体的间接ELISA方法。周云雷等[10]以MG PvpA蛋白作为抗原建立的ELISA检测方法，该方法有较好的特异性，但稳定性有待改善，且该研究没有对临床样本分析，其检测临床样品的准确性未知。胡思顺等[11]对MG vlha1.2基因进行了原核表达，但其研究只停留在蛋白表达阶段，对其特异性是否良好未进行后续评估。

目前国内外MG的VLHA黏附、感染作用机理等方面报道较为常见，利用其作为诊断抗原建立检测方法少见报道。为进一步研究MG的VLHA蛋白，本试验通过构建MG Rlow株VLHA3.03蛋白的原核表达载体，成功获得重组VLHA3.03蛋白，并进一步分析了其免疫原性和免疫反应性，证实其可作为MG血清抗体检测的候选抗原靶标，为MG诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了研究基础。

1 材料和方法

1.1 菌种、质粒、试剂、血清及实验动物 鸡毒支原体MG Rlow菌株购自中国兽医药品监察所；MG 08、MG 013、MG FBH、MG SGN、MG SS菌株由山东畜牧兽医职业学院隋兆峰老师课题组惠赠；pCold I表达载体、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），细菌基因组DNA提取试剂盒，诱导剂IPTG购自天根生化（北京）科技有限公司；BeaverBeadsTMHis-tag蛋白纯化试剂盒购自苏州海狸生物医学有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma-Aldrich公司；HRP标记羊抗兔IgG购自Abcam公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；ECL化学发光试剂盒购自上海圣尔生物科技有限公司；MG平板凝集试验抗原和MS标准阳性鸡血清购自中国兽医药品监察所；新西兰大白兔购自上海杰思捷实验动物有限公司；SPF鸡购自浙江立华农业科技有限公司。

支原体培养基基础购自青岛海博生物技术有限公司；马血清购自美国Hyclone公司；Tryptone、Yeast extract、琼脂购自Oxoid公司；鸡毒支原体液体培养基[12]：支原体基础培养基26.4 g溶解于800 mL ddH2O中，高压灭菌15 min，冷却至室温，无菌加入10%马血清；LB液体培养基：Tryptone 8 g、Yeast extract 4 g、NaCl 8 g溶解于800 mL ddH2O中高压灭菌后备用。LB固体培养基：在上述液体LB培养基基础上加入12 g琼脂高压灭菌后制成平板放入4℃冰箱备用。

1.2 生物信息学分析 从GenBank数据库查找MG Rlow株VLHA3.03蛋白的氨基酸序列（AAP56941.1），将获取的VLHA3.03蛋白的氨基酸序列上传至在线分析软件SignalP 4.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）、TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），分别预测VLHA3.03蛋白的信号肽以及该蛋白的跨膜区；用Blastp检索nr数据库（Refseq non-redundant protein sequences），分析VLHA3.03氨基酸序列与其他病原菌来源VLHA3.03的同源性，并用MEGA 5.0软件进行序列比对分析并构建进化树。

1.3 MG各阳性鸡血清的制备 取待复苏菌液（MG Rlow、MG 08、MG 013、MG FBH、MG SGN、MG SS菌株），按5%接种比例转接到鸡毒支原体液体培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养1～3 d，待液体培养基由红色变为橙黄色时，按6×108CCU/只的剂量对3周龄的SPF鸡进行气管攻毒，攻毒后两周用翅下静脉采血方法进行采血，采后放37℃、5%CO2培养箱中20 min后，放入4℃冰箱中6 h，离心（8000×g，5 min）后吸取上层血清液，放入-40℃冰箱中长期保存。另取未攻毒的SPF鸡血清作为阴性对照，并用MG平板凝集试验抗原检测制备的MG感染血清是否为阳性。

1.4 MG Rlow菌株培养及全基因组提取 取冻存MG Rlow菌株，5%转接后37℃、5%CO2培养箱中静置培养1～3 d，取对数生长期末期的MG培养物1 mL离心，12 000×g离心20 min收集菌体，用无菌PBS重悬，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取MG Rlow的基因组，得到基因组后用微量分光光度计测定其浓度，后可放于-20℃长期保存。

1.5 Overlap PCR扩增vlha3.03基因 根据GenBank数据库分析MG Rlow株的vlha3.03基因序列（MGA_0380），由于支原体中编码色氨酸的TGA需将A突变为G才能在原核表达载体中正确翻译，通过分析vlha3.03序列发现在第784位、892位及1342位上均需要进行A到G的点突变。使用Vector NT1 10软件在这三处设计4对引物，用Overlap PCR扩增方式进行突变。将引物vlha3.03 1F/1R、vlha3.03 2F/2R、vlha3.03 3F/3R及vlha3.03 4F/4R分别扩增获得vlha3.03各个片段，使用的PCR反应体系（总体系40 μL）为：2×Prime STAR MAX Premix 20 μL，F/R引物各0.25 μmol/L（各1 μL），MG Rlow基因组DNA 100 ng（1 μL），剩余由ddH2O补足。PCR程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃再延伸10 min；各分段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行凝胶回收。将胶回收产物各取1 μL作为模板，以vlha3.03 1F/4R为引物进行全长扩增，反应体系及程序同前，从而得到完整的vlha3.03基因片段。

表1 vlha3.03基因Overlap PCR扩增引物序列Table 1 Primer sequences for overlap PCR amplification of vlha3.03 gene

1.6 载体构建及重组蛋白表达纯化 将vlha3.03全基因片段和空载质粒pCold I用KpnⅠ和HindⅢ双酶切后连接转化至E. coliBL21（DE3）中，涂布于LB固体平板（含氨苄青霉素100 μg/mL）上过夜培养，挑取单克隆菌落置于带氨苄抗性的液体LB培养基中培养，进行菌液PCR鉴定（PCR体系：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μmol/L，待鉴定菌液2 μL，ddH2O补足至20 μL；反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃再延伸10 min），同时抽提质粒进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将序列完全正确的重组菌株扩大培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.05 μg/mL的IPTG，于16℃ 150 rpm诱导表达24 h。收集菌体，用Binding buffer重悬，经超声破碎仪处理后分别收集上清液和沉淀，用聚丙烯凝胶电泳检测目的蛋白表达情况。用BeaverBeadsTMHistag蛋白纯化试剂盒中的磁珠吸附上清蛋白，按照试剂盒说明书操作，从而得到纯化重组蛋白rVLHA3.03，最后用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。

1.7 抗rVLHA3.03兔血清的制备及其效价测定 准备2月龄新西兰大白兔1只，在免疫前对其进行耳缘静脉采血，分离免疫前兔血清。按500 μg/只剂量免疫，纯化蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对兔进行背部皮下多点免疫。免疫间隔为14 d，共免3次，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，方法同上。在第3次加强免疫后1周对大白兔进行耳缘静脉采血分离血清，即为抗rVLHA3.03兔血清，用纯化后的rVLHA3.03蛋白作为包被抗原，上样量为0.5 μg/孔[13]，4℃包被过夜；5%脱脂乳37℃封闭2 h；首先孵育倍比稀释的免疫后血清（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400）和未免疫兔血清（阴性对照），再孵育HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀释），最后用酶标仪测定OD450值。

1.8 重组蛋白的免疫原性鉴定 取纯化后重组蛋白rVLHA3.03按0.5 μg/孔上样，进行SDS-PAGE电泳，随后转印（250 mA, 90 min）至NC膜。将膜置于5%脱脂乳溶液中室温封闭2 h，封闭后的NC膜用PBST（PBS溶液中添加0.05%Tween-20）洗3次，每次10 min。然后将膜置于抗rVLHA3.03兔多克隆抗体（用PBST按1∶1000稀释）中常温孵育1.5 h，PBST洗4次，每次10 min。另选择兔免前血清（用PBST按1∶1000稀释）孵育另一张NC膜作为阴性对照，条件同上。再用HRP标记的羊抗兔IgG（用PBST按1∶5000稀释）作为二抗常温孵育1 h，PBST洗3次，每次20 min；加入ECL底物，采用化学发光检测仪扫描获得目的条带。

1.9 重组蛋白的反应原性鉴定 取纯化后蛋白rVLHA3.03，按0.5 μg/孔上样进行SDS-PAGE电泳，转印后的NC膜用5%脱脂乳4℃封闭过夜，经PBST洗涤3次后，与MG Rlow、MG 08、MG013、MG FBH、MG SGN、MG SS阳性鸡血清（1∶1000）常温孵育1 h[13]，PBST洗涤3次后，用HRP标记的羊抗鸡IgY抗体（1∶5000）常温孵育1 h，PBST洗涤3次后，加入ECL底物显色液进行显色反应。

2 结果

2.1 生物信息学分析 MG Rlow株的VLHA 3.03蛋白有645个氨基酸。经TMHMM Server v2.0和SignalP 4.1 Sever预测，VLHA 3.03蛋白无跨膜区，无信号肽；通过Blastp将VLHA3.03蛋白序列比对nr数据库，用MEGA 5.0软件进行序列比对分析并构建进化树（图1）。结果显示MG Rlow的VLHA 3.03蛋白序列与MGS6菌株的VLHA同源性高达96%，与模仿支原体（M. imitans）和猪鼻支原体（M. hyorhinis）的同源性在45%～49%，与牛支原体（M. bovis）、发酵支原体（M. fermentans）、滑液支原体（M. synoviae）等支原体几乎无同源性。

图1 VLHA蛋白的进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of VLHA protein

2.2 重组表达载体的构建 用引物对vlha3.03基因进行Overlap PCR扩增，第一轮PCR扩增获得4个片段（图2A），大小分别为794、142、475和552 bp。第二轮PCR扩增获得突变后vlha3.03基因全长，大小为1890 bp（图2B）。将突变后的vlha3.03基因连接至表达载体pColdⅠ，转化E. coli BL21后进行菌落PCR鉴定（图2C），选取一株阳性菌株抽提质粒，质粒双酶切后得到大小符合预期的片段（图2D）。将阳性质粒测序分析后确定vlha3.03序列完全正确且两处位点成功突变。

图2 vlha3.03基因和vlha3.03-pColdⅠ重组载体的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of vlha3.03 gene and vlha3.03-pColdⅠ

2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化 将vlha3.03-pColdⅠ转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞后，用IPTG诱导表达VLHA3.03蛋白。取诱导前的全菌蛋白、诱导后的全菌蛋白、诱导后的菌体上清液及纯化后重组蛋白分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果发现71 kDa左右有明显的蛋白表达条带（图3）。

图3 重组rVLHA3.03蛋白的表达及纯化Fig.3 Expression and purification of recombinant rVLHA3.03 protein

2.4 rVLHA3.03免疫原性鉴定 取纯化的rVLHA3.03蛋白免疫实验兔后，采集抗rVLHA3.03兔血清。用rVLHA3.03包被的ELISA板对其进行效价测定，结果显示抗rVLHA3.03兔血清的抗体效价为1∶102 400。Western blot分析结果显示，抗rVLHA3.03兔血清能与纯化的rVLHA3.03在相应位置发生特异性反应条带，与兔免疫前血清未发生反应条带。以上结果表明，rVLHA3.03蛋白免疫兔体能产生相应抗体，且抗体效价较高。表明其具有良好的免疫原性（图4）。

图4 rVLHA3.03免疫原性鉴定Fig.4 Immunogenicity identification of rVLHA3.03 protein

2.5 rVLHA3.03免疫反应性鉴定 为鉴定r VLHA3.03蛋白的免疫反应性，将rVLHA3.03蛋白分别与MG的不同分离株（MG Rlow、MG 08、MG 013、MG FBH、MG SGN和MG SS）的阳性感染血清、MS标准阳性鸡血清进行Western blot反应，并以SPF鸡血清为阴性对照。结果显示，rVLHA3.03蛋白与MG不同分离株的阳性鸡血清均可反应生成显著性结合条带，与SPF鸡阴性血清及MS标准阳性鸡血清无反应条带（图5），可见VLHA3.03蛋白具有较好的免疫反应性及特异性。

图5 rVLHA3.03蛋白与MG不同分离株阳性鸡血清的Western blot鉴定Fig.5 Western blot analysis of rVLHA3.03 protein against MG-positive sera from chickens infected by different MG isolates

3 讨论

近年来，MG感染在国内发病频繁，并已成为当下威胁家禽健康的主要疫病之一。虽然MG感染很少引起鸡只死亡，但其常与其他病原共同感染，导致蛋鸡产蛋量及鸡蛋品质下降、种蛋孵化率降低、肉鸡生长发育迟缓、饲料转化率低，使养殖业损失严重[14]。同时，病禽一般终生带菌，极难根除，对商业家禽养殖和生产操作造成重大经济损失[15]。因此，对鸡群MG感染进行及时准确的诊断，有助于MG病的防控和净化。目前，针对MG诊断方法有病原分离、血清学和分子生物学检测。其中血清学检测具有取材方便、操作简单、诊断率高、检测时间短等优点，成为目前MG 病诊断的主要方法。临床上常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）、血凝试验（hemagglutination inhibition, HI）、平板凝集试验（SPA）、酶联免疫斑点试验和胶体金技术等。但HI敏感性较差，极易出现假阳性[16]。SPA特异性低，容易造成交叉反应和非特异性反应。ELISA可同时检测大量的样品，且有特异性高、敏感性强、快速、简单、检测成本低、结果可量化等优势，成为血清学检测中的首选方法。想要建立特异性高、敏感性好的ELISA检测方法，筛选到好的诊断抗原靶标是关键。

编码VLHA蛋白的vlha基因家族在MG基因组中是一个庞大的家族，同一株菌中通常有多个vlha编码基因，通过向宿主免疫系统递呈具有抗原变异性的粘附素，躲避宿主免疫系统的攻击[17]。Markham等[18]在研究中提出了血凝素、LP64结合素、VLHA可能指同一种蛋白。Forsyth等[19]通过研究证实LP64具有高度的免疫原性，它是MG的血凝素分子和粘附因子。MG的VLHA具有很强的特异性，是目前MG遗传进化分析采用最多的靶基因之一[20]。同时，MG的VLHA也是其重要的膜蛋白和免疫原性抗原。Pflaum等[21]通过研究发现疫苗株Mg7、GT5与野生型强毒R株在感染过程，不同时间内vlha基因表达的变化规律，进一步揭示了vlha在鸡毒支原体的定殖和感染过程中发挥的重要作用。苗得园等[22]发现MG各株中能清晰分辨且共同拥有的蛋白带有45条。有6条能与每株抗血清都发生良好反应的蛋白带，其分子量大致为130、100、69、66、64及42 kDa。本实验将MG Rlow株的VLHA3.03蛋白进行了原核表达，并将其免疫实验兔，制备了抗rVLHA3.03的兔血清。Western blot试验显示，rVLHA3.03能与制备的抗rVLHA3.03的兔血清有显著反应条带，说明该蛋白具有良好的免疫原性。同时，我们用MG不同分离株的感染血清与rVLHA3.03进行了Western blot试验，结果显示VLHA3.03蛋白和MG Rlow、MG 08、MG 013、MG FBH、MG SGN、MG SS的感染阳性鸡血清均有明显反应条带，与MS标准阳性鸡血清无反应条带，说明该蛋白有良好的免疫反应性和特异性，提示其可作为MG抗体诊断的靶标蛋白。

本研究用原核表达系统，成功获得MG的rVLHA3.03蛋白，并证实其具有较好的免疫原性和免疫反应性，为今后MG亚单位疫苗的研究及血清抗体水平的检测奠定了基础。