1株柔嫩艾美耳球虫ITS-1部分序列测定与分析

魏冬霞，袁 橙，刘剑华，薛咏佩

（江苏农牧科技职业学院 动物医学院，泰州 225300）

鸡球虫病是由原生动物门（Protozoa）复顶亚门（Apicocomplexa）孢子虫纲（Sporozoasida）真球虫目（Eucoccidiorida）艾美耳亚目（Eimeriorina）艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳属（Eimeria）的多种球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种对养鸡业危害十分严重的原虫病[1]。该病呈世界性分布，以雏鸡多发、出血性肠炎和雏鸡高死亡率为主要特征，病愈的雏鸡生长发育受阻，长期不能康复，成年鸡多为带虫者，但增重和产蛋都受到影响[2-3]。目前公认的感染鸡的艾美耳球虫有7个种，分别是柔嫩（E. tenella）、毒害（E. necatrix）、布氏（E. brunetti）、巨型（E. maxima）、堆型（E.acervulina）、和缓（E. mitis）和早熟（E. praecox）艾美耳球虫[4]。传统方法是依据球虫卵囊的特征、寄生部位、病变特征、潜隐期等进行种类鉴定[5]，但许多虫种在卵囊的形态、寄生部位、致病性、潜隐期等方面有许多相似之处，在混合感染的状态下，单凭肉眼难以鉴别。核糖体第一内转录间隔区（first internal transcribed spacers, ITS-1）序列存在于高度重复的核糖体中，它的进化速度快且序列较短，适用于种间的遗传关系分析、虫种的鉴定及分类[6-18]。本研究根据已发表的柔嫩、堆型、布氏、巨型、和缓、毒害、早熟艾美耳球虫的ITS-1序列引物[13-16]，对江苏泰州地区某草鸡养殖场发病鸡粪便中分离的球虫卵囊进行PCR扩增，结果显示柔嫩艾美耳球虫的引物扩增出阳性条带，对阳性产物测序后进行了序列的同源性分析和系统进化关系分析，发现本研究中的分离株为柔嫩艾美耳球虫。

1 材料与方法

1.1 虫株来源 鸡球虫卵囊来自泰州姜堰某草鸡养殖场发病鸡的新鲜粪便，发病鸡只情况：20日龄，有零星血便，盲肠肿大，有出血点和出血斑，其他肠管正常。

1.2 主要试剂 Stool DNA Kit为Omega BIO-TEK公司产品；2× Phanta Turbo Master Mix DNA聚合酶、核酸染料GelRed、DL2000 Plus DNA marker等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；氯化钠、蔗糖等试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

1.3 球虫卵囊分离 将新鲜的鸡粪便置于烧杯中，加入20倍粪便重量的饱和糖盐水，搅拌后用60目的金属筛过滤，滤液收集于离心管后3000 ×g离心10 min；随后将离心管置于试管架上，用直径是1 cm的金属圈蘸取液面后，抖落于装有蒸馏水的烧杯中，反复蘸取多次，直到随机蘸取液面检测，仅检测到少量的卵囊为止。将含有卵囊的蒸馏水3000 ×g离心10 min，弃去上清液，再在沉淀物中加入蒸馏水混匀后，离心并弃去上清液，反复洗涤3次，最后取沉淀物收集于2.5%重铬酸钾溶液中备用。

1.4 球虫卵囊的孢子化 将保存于2.5%重铬酸钾溶液中的卵囊放入培养皿，搅拌后置于26℃恒温培养箱培养。在培养过程中每天需搅动培养液数次，使球虫卵囊在孢子化过程中有足够的氧气，同时，每天对卵囊的孢子化程度进行观察，并随机取50个卵囊测量大小。

1.5 卵囊DNA的提取 按照Omega Stool DNA Kit说明书的操作步骤提取纯化后球虫卵囊的DNA，抽提的DNA保存于-35℃备用。

1.6 PCR的扩增和测序 根据Jenkin等[13]发表的柔嫩（E. tenella）、毒害（E. necatrix）、布氏（E.brunetti）、巨型（E. maxima）、堆型（E. acervulina）、和缓（E. mitis）和早熟（E. praecox）艾美耳球虫ITS-1的引物序列[13-16]，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成（表1）。用合成的引物对提取的DNA模板进行扩增。扩增体系为：2× Phanta Turbo Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板（50～100 ng/μL）2 μL，补加7 μL ddH2O，总体积为20 μL。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，各引物退火温度见表1，退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环后；72℃延伸10 min。然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并记录结果。并将鉴定为阳性的PCR产物送测序公司测序。

表1 鸡艾美耳球虫的ITS-1特异性引物的DNA序列、退火温度和扩增产物的预测大小Table 1 DNA sequence, annealing temperatures of ITS-1 primers and predicted size of amplification products derived from ITS-1 PCR amplification of Eimeria spp. DNA

1.7 ITS-1序列分析及系统发育树构建 PCR产物测序结果在GenBank上进行BLAST搜索，下载同源性较高的球虫的相关序列（表2），并用DNAStar软件进行同源性分析，同时用MEGA5.05软件进行进化分析。应用MEGA5.05（分子进化遗传分析）中的Kimura双参数模型计算不同鸡球虫虫种间的遗传距离，再应用MEGA5.05中的邻接法（neighbor-joining method），即NJ法构建不同虫种间ITS-1序列的系统发育进化树，同时通过自举分析（bootstrap）作置信度检测，bootstrap为1000次，大于50%以上认为支持。

表2 用于比对的艾美耳球虫ITS-1基因序列信息（下载于GenBank）Table 2 Sequence information of the ITS-1 gene of Eimeria spp. in this study (downloaded from GenBank)

2 结果与讨论

2.1 卵囊的形态构造 分离到的球虫卵囊多为宽卵圆形，少数为椭圆形；卵囊壁为淡绿黄色，原生质呈淡褐色；大小为20.5～26 µm×16.5～22.5 µm。经28 h孢子化后，卵囊内有富有折光性的极粒、一个颗粒状团块的卵囊残体和4个孢子囊。每个孢子囊内含有2个呈香蕉样子孢子（图1）。一般认为有7种球虫可以感染鸡，从形态、结构和孢子化时间来看，本次分离的球虫卵囊和柔嫩艾美耳球虫特征相符，但由于几种鸡球虫在形态结构上存在较大的相似性，很难通过卵囊特征来鉴定虫种，因此，不能排除是其他球虫卵囊的可能性，而且，在鸡场中几种球虫混合感染的现象在生产中较为常见，因此需要对此次分离的球虫卵囊开展进一步的鉴定。如果能快速鉴定，可以帮助兽医或者养殖户拟定球虫病防治方案，选择合适的抗球虫药物和疫苗防治该病。

图1 孢子化球虫卵囊（1000×）Fig.1 Sporozoited oocysts of Eimeria spp. (1000×)

2.2 PCR扩增结果 将获得的DNA模板分别用合成的7种球虫的ITS-1引物扩增，结果用柔嫩艾美耳球虫ITS-1引物成功扩增出约270 bp的条带，其他6种球虫的引物未扩增出条带。经测序证实该阳性条带大小为279 bp，与Schnitzler等[14]预期的长度278 bp基本一致（预计大小），见图2。将获得的序列输入GenBank上进行Blastn，发现本次扩增出的序列与夏延富等[6]上传的柔嫩艾美耳球虫（上海株）的ITS-1序列（GenBank登录号：GQ153633）其中一段的一致性达100%（279/279）。

图2 扩增结果电泳图Fig.2 Electrophoretogram of amplification results

2.3 艾美耳球虫ITS-1基因的同源性分析结果 对本研究的分离株E. tenella isolate TZ测序后得到279 bp的ITS-1序列。用DNAStar软件的CLUSTAL W功能，将该序列与GenBank上一致性较高的序列进行同源性分析，分析结果见图3。从图中可知本研究所获得的序列与已发表的其他地方柔嫩艾美耳球虫的ITS-1序列一致性达99.6%～100%，其中与安徽株（JX477100）、上海株（GQ153633）的相似度达100%，具有较高的同源性。与其他柔嫩艾美耳球虫的一致性均为99.6%。李巍等[8]基于ITS-1序列建立了鸡艾美耳球虫套式PCR鉴别检测方法，测序结果和序列比对分析显示不同柔嫩艾美耳球虫虫株的ITS-1序列一致性为98.5%。Li等[17]对来自中国湖北省8个地区的21株柔嫩艾美耳球虫ITS-1序列进行扩增和分析，显示其同源性为92.5%～100%。本序列与其他柔嫩艾美耳球虫的序列一致性分析结果（99.6%～100%）略高于李巍等[8]研究结果（98.5%）和Li等[17]研究结果（92.5%～100%），这可能是由于本研究中所选取的比对序列为在GenBank上Blastn一致性较高的序列，而与他们所选择的比对序列不同所致。

图3 分离株TZ和柔嫩艾美耳球虫相似度分析结果Fig.3 Similarity analysis results of isolates TZ and E. tenella

2.4 ITS-1序列系统发育树构建 应用MEGA5.05（分子进化遗传分析）中的Kimura-双参数模型计算球虫间的遗传距离，再应用MEGA5.05中的NJ法构建感染鸡的7种常见球虫虫种间ITS-1序列的进化关系，同时通过自举分析（bootstrap）作置信度检测，bootstrap为1000次，大于50%以上认为支持，以鸡蛔虫为外源基因构建进化树（见图4）。本研究所分离的球虫虫株与几株柔嫩艾美耳球虫的ITS-1区的亲缘关系较近，可信度为94%。除了巨型艾美耳球虫外，其他6种球虫位于一个大的分支上，柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫形成一个小分支，亲缘关系较近。此分析结果与夏延富等构建的6种鸡艾美耳球虫（不含布氏艾美耳球虫）的ITS-1系统发育树分析结果一致，即柔嫩艾美耳球虫与毒害艾美耳球虫位于同一个小分支，遗传进化关系较近[6]。在系统发育树中和缓、堆型和早熟艾美耳球虫形成另一个小分支。

图4 基于ITS-1基因序列的NJ法所构建的系统进化树（NJ法）Fig.4 Phylogenetic tree of Eimeria spp. isolate TZ based on partial sequences of ITS-1 gene by NJ method

本研究根据已报道的7种球虫的ITS-1基因扩增引物序列合成引物，并对反应条件进行了优化，对分离的球虫卵囊进行了PCR鉴定，用一对扩增柔嫩艾美耳球虫序列的特异性引物扩增获得目的条带。测序后，经同源性分析和系统发育树分析发现该虫株与柔嫩艾美耳球虫安徽株和上海株的亲缘关系最近，结合鸡只发病日龄（20日龄）、临床表现（有血便）、病理变化（盲肠肿大、出血）、孢子化时间（28 h）以及卵囊的特征等分析该草鸡养殖场鸡只此次感染的主要致病球虫虫种为柔嫩艾美耳球虫。