蔗糖对发根农杆菌C58C1诱导烟草毛状根生长的影响

向润　江龙

摘要：毛狀根良好的生长状况是建立毛状根AM真菌双重培养体系的关键，为优化毛状根培养基成分，确定适宜毛状根生长的蔗糖浓度，改善烟草毛状根的生长状况，该研究以发根农杆菌菌株C58C1诱导2个烟草品种NC82和Va116叶片产生毛状根，经PCR检测证实后，用含有不同蔗糖浓度的1/2MS培养基分别进行固体和液体优化培养，通过测定毛状根的分枝数、鲜重（FW）与干重（DW），研究蔗糖对2个品种烟草毛状根生长的影响。结果表明：（1）C58C1均能诱导两种烟草叶片产生毛状根，但诱导率不同，NC82（87.3%）的诱导率更高，是Va116（38.6%）的2.26倍。（2）培养基蔗糖浓度显著影响毛状根生长，因烟草品种和起始分枝数而异。（3）固体培养基优化培养NC82和Va116的毛状根，分枝数增长的抑制蔗糖浓度分别为25 g·L1和15 g·L1;液体培养基优化培养分别在25 g·L1和15 g·L1时F（D）W达到最大，分别为0.541 g（0.055 g）、0.474 g（0.050 g）。（4）综合分枝数、F（D）W、毛状根生长势考虑，C58C1诱导NC82毛状根最适培养基蔗糖浓度为25 g·L1，Va116毛状根为15 g·L1。该文优化了烟草毛状根培养基组成的适宜蔗糖浓度及培养方法，为后续毛状根大量扩繁奠定基础，建立了毛状根AM真菌双重培养体系，解决了关键的寄主生长不良的问题。

关键词： 毛状根， 蔗糖， 培养基优化， 分枝数， 鲜重， 干重

中图分类号：Q945

文献标识码：A

文章编号：10003142（2022）05080209

Effects of sucrose on growth of tobacco hairy roots

induced by Agrobacterium rhizogenes C58C1

Abstract：As the host， the hairy roots have good growth conditions， which is the key to establish the hairy rootAM fungus dual culture system. In order to optimize the medium composition， to screen the sucrose concentration suitable for the growth of hairy roots and to improve the growth of tobacco hairy roots， leaf growth of two types of tobacco， NC82 and Va116 were induced to have hairy roots through solid and liquid culture on 1/2MS medium with different sucrose concentrations and confirmed by PCR. The effects of sucrose on the growth of two tobacco hairy roots were studied by measuring the number of branches， fresh weight （FW） and dry weight （DW） of hairy roots. The results were as follows： （1）C58C1 could induce hairy roots in both tobacco leaves， but the induction rates were different. The induction rate of NC82 （87.3%） was higher， which was 2.26 times that of Va116 （38.6%）. （2） The number of hairy root branches induced by NC82 and Va116 increased with the incubation time， and the increased amount varied with the concentration of sucrose. Sucrose has a significant effect on the growth of hairy roots， depending on the tobacco variety and the number of initial branches. （3） The solid medium was optimized to cultivate the inducedNC82 and Va116 hairy roots， and the inhibitory sucrose concentrations for branch number growth were 25 g·L1 and 15 g·L1， respectively. In addition， the results of liquid optimized culture showed that the hairy roots induced by NC82 and Va116 reached the maximum F（D）W at 25 g·L1 and 15 g·L1， respectively， which were 0.541 g （0.055 g） and 0.474 g（0.050 g） respectively， which was mutually corroborated with solid optimized culture. （4） The present data suggested that the concentration of sucrose in the medium significantly affected the growth of hairy roots. Considering the number of branches， F（D）W， and hairy root growth vigor， C58C1 induced NC82 hairy roots with optimal sucrose concentration was 25 g·L1， and the hairy roots of Va116 was 15 g·L1. The study of tobacco hairy roots optimized the suitable sucrose concentration in the medium， laying a foundation for subsequent largescale propagation of hairy roots; at the same time， established a hairy rootAM fungus double culturing system and solved the problem of poor growth of hairy roots as a host.

Key words： hairy root， sucrose， optimization of medium， branch number， fresh weight， dry weight

丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌能与地球上80%以上的陆生维管植物形成互惠共生体（夏庭君等，2018），可促进植物吸收土壤矿质营养（江龙等，2010），提高植物抗逆性、抗病性（Augé et al.，2015;王丹丹等，2019），改善土壤结构（Rillig & Mummey，2010;Leifheit et al.，2014;），修复土壤重金属污染等（Meier et al.，2015），既可作天然菌肥，又可作生防制剂，在农（林）业生产中，具有广阔的应用前景。但AM真菌是专性共生体，需与寄主植物共生，才能生长和完成生活史，所以AM真菌目前还不能纯培养， 这使得AM真菌菌剂规模化生产受到极大限制（Berruti et al.，2016）。以Ri TDNA轉型根（以下简称毛状根）为寄主，接种AM真菌孢子，建立毛状根AM真菌双重培养体系，是解决AM真菌纯培养和菌剂规模化生产的有效途径（Jolicoeur et al.，1999）。冉海燕（2016）研究表明，毛状根的生长状况对AM真菌的侵染、生长发育和产孢均有显著影响，是建立毛状根AM真菌双重培养体系的关键条件。

利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染植物叶片等外植体，其自身携带的Ri 质粒上的TDNA片段在进入植物细胞后随机整合，利用植物体内的酶系统进行转录和表达，可产生大量毛状根（Kregtenmv et al.，2016）。毛状根是利用转基因技术实现的，经遗传转化筛选得到的单克隆体，具有很强的稳定性。本项目前期研究表明，发根农杆菌菌株C58C1可诱导烟草叶片产生毛状根，但毛状根的生长状况受到培养基组成、植物生长物质、培养条件的影响（卢锡锋，2020）。在毛状根培养中，培养基常用的碳源有蔗糖、果糖和葡萄糖，毛状根快速生长需要较多的碳原子数和较高的能量（李凤华等，2004），葡萄糖和果糖的碳原子数和能量都不如蔗糖，蔗糖更易于被植物细胞感知，分解转化获得较高能量，有利于毛状根生长（Gibson，2005）。建立烟草毛状根AM真菌双重培养体系的首要条件是要有良好的毛状根培养体系，因为培养基中蔗糖浓度会直接影响烟草毛状根生长。

本研究以发根农杆菌菌株C58C1诱导2个烟草品种NC82和Va116叶片产生毛状根，经PCR检测证实后，将毛状根置于含有不同蔗糖浓度的1/2MS培养基中进行优化培养，通过测定毛状根的分枝数、鲜重和干重，旨在研究蔗糖浓度对2个品种烟草毛状根生长的影响，从而确定烟草毛状根优化培养基组成的适宜蔗糖浓度及培养方法，以期为建立烟草毛状根AM真菌双重培养体系提供基础条件，也为其他植物材料诱导毛状根提供参考。

1材料与方法

1.1 实验材料

发根农杆菌菌株：C58C1，由贵州大学生命科学学院生物化学实验室提供。烟草品种：NC82、Va116，由贵州大学生命科学学院植物生理实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 毛状根诱导烟草无菌苗的获得：参考卢锡锋（2020）的方法，用75%酒精和10%次氯酸钠消毒获得烟草无菌苗。

发根农杆菌C58C1菌种侵染液制备：参考卢锡锋（2020）方法进行菌液活化，用MS液体培养基（含100 umol·L1乙酰丁香酮）悬浮，即侵染菌液。

诱导毛状根：参考卢锡锋（2020）的方法，将经预培养2～3 d的烟草叶片（2 cm × 2 cm）放入悬浮菌液，侵染约8～10 min，置于MS培养基上（培养基中蔗糖浓度为30 g·L1），黑暗条件下共培养2～3 d后，转入抑菌培养基（含500 mg·L1 头孢霉素、100 mg·L1特美汀），诱导出毛状根。挑选生长快、长势旺盛且分枝多的毛状根，用1/2MS培养基进行扩繁，25 ℃暗培养，供毛状根优化培养阶段选用。

1.2.2 毛状根的优化培养及生长测定PCR检测：参考胡霄等（2015）的方法，使用PCR对NC82和Va116两种烟草叶片诱导产生的根进行检测。

固体优化培养：用1/2MS固体培养基培养诱导得到的毛状根，其中设置不同烟草品种（NC82和Va116）、起始分枝数（起始0分枝和1～2分枝）、蔗糖浓度（0、5、10、15、20、25、30、35、40 g·L1）3个因素，共36个处理，每个处理3组，每组3皿（培养皿直径90 mm）。调节培养基pH至5.8～6.0，培养时毛状根于25 ℃暗培养，每2天统计不同起始分枝量毛状根在不同处理的分枝数，累计20 d。

液体优化培养：在固体优化培养的基础上，配制1/2MS液体培养基，其中蔗糖浓度分别为15、20、25、30 g·L1，4个处理，每个处理3个重复，调节pH至5.8～6.0，每150 mL锥形瓶装入80 mL培养基，灭菌冷却备用。在超净台中取活力较好的毛状根置于含有不同蔗糖浓度的培养基中，25 ℃避光悬浮培养，转速为110 r·min1。悬浮培养30 d后，迅速用滤纸擦干，测得鲜重（fresh weight，FW），然后在102～105 ℃烘箱中杀青10 min，把烘箱温度降低至70～80 ℃烘至恒重，冷却至室温测其质量为干重（dry weight，DW）。

毛状根诱导率（%）=（产生毛状根的外植体数量/外植体总数量）×100。

实验数据采用Microsoft Excel 2010软件和SPSS 22.0软件进行分析。

2结果与分析

2.1 毛状根诱导状况及PCR鉴定结果

发根农杆菌C58C1可诱导NC82和Va116两种烟草叶片产生毛状根。用菌液将NC82和Va116两种烟草叶片进行侵染，一周左右叶片伤口处出现毛状根，12 d后C58C1对NC82和Va116的毛状根诱导率分别为54.4%和20.5%，一周后（19 d）增加到87.3%和38.6%。诱导出的毛状根分枝多，生长速度快，可在无激素培养基上正常生长（图1）。

经PCR检测，NC82和Va116两种烟草叶片诱导产生的根均为毛状根。两种烟草毛状根的DNA经PCR扩增后，均检测出特异性扩增产物，通过与发根农杆菌C58C1阳性对照和DNA分子量标记（M）比较，可确定待测毛状根中均含有rolB基因的片段（约741 bp）（图2），结果表明发根农杆菌中Ri质粒的rolB基因已整合入NC82与Va116细胞基因组中，rolB基因表达使两种烟草叶片长出毛状根。

2.2 蔗糖浓度对毛状根生长的影响

2.2.1 固体培养基不同蔗糖浓度对毛状根分枝增长的影响结果表明，NC82和Va116诱导的毛状根分枝数量随培养时间而增加，增加量因蔗糖浓度而异（图3，图4）。蔗糖浓度为0和5 g·L1时，NC82和Va116起始0分枝和1～2分枝的毛状根分枝增加量均为最低，在培养4 d后，分枝数增加到8条趋于停止;蔗糖浓度为10 g·L1时，除NC82起始1～2分枝的毛狀根在培养14 d后，分枝数增加到18条趋于停止，其余处理随培养时间而增加。蔗糖浓度为15、20、25、30、35、40 g·L1时，各处理的毛状根分枝数均随培养时间而增加，培养20 d时，毛状根分枝数均为最大，其中NC82起始0分枝，毛状根分枝数分别达到18、27、26、23、13、15，起始1～2分枝，达到32、29、71、54、24、31。Va116起始0分枝，毛状根分枝数达到29、12、25、8、8、16，起始1～2分枝，达到75、30、40、25、24、25。

蔗糖浓度显著影响NC82和Va116诱导的毛状根分枝数量，因烟草品种和起始分枝数而异（图5，图6）。在蔗糖浓度为0～40 g·L1范围内，各处理毛状根分枝数量均呈现随蔗糖浓度先增加后减少的变化规律，不同蔗糖处理存在其特有抑制浓度。NC82起始0分枝的毛状根分枝数量在蔗糖浓度为0～20 g·L1时，随浓度增加，毛状根分枝数量增加，培养20 d时，达到27条分枝，20 g·L1为其抑制浓度，超过后，随浓度增加毛状根分枝数量减少;NC82起始1～2分枝的抑制浓度为25 g·L1。Va116起始0分枝的抑制浓度为15 g·L1，1～2分枝为15 g·L1。

所以，固体培养基优化培养中，NC82诱导的毛状根适宜的蔗糖浓度为20～30 g·L1，Va116诱导的毛状根为15～25 g·L1。

2.2.2 液体培养基中不同蔗糖浓度对毛状根重量的影响蔗糖浓度显著影响NC82和Va116诱导的毛状根生长量的积累和生长状况，因烟草品种而异 （图7，表1）。在蔗糖浓度15～30 g·L1范围内，NC82诱导的毛状根FW和DW呈现先增加后减少的规律，在蔗糖浓度为25 g·L1时FW和DW最高，分别为0.541 g和0.055 g。Va116诱导的毛状根不同，在15 g·L1时FW和DW最高，分别为0.474 g和0.050 g，之后随蔗糖浓度增加逐渐减少。培养30 d后，15 g·L1处理NC82和Va116诱导的毛状根分枝较多，根体较细且褐化少;30 g·L1处理毛状根分枝变少，且褐化明显，褐化的毛状根变粗、变硬，脆而易断（图7）。

综合固体优化培养毛状根分枝数的增加和液体优化培养毛状根的F（D）W，可得出结论：发根农杆菌C58C1诱导烟草NC82和Va116毛状根最适宜的培养基蔗糖浓度分别为25 g·L1和15 g·L1。

3讨论与结论

AM真菌专性共生的特性限制了其在农（林）业生产中的应用，以毛状根为寄主，接种AM真菌孢子，建立毛状根AM真菌双重培养体系，是解决AM真菌纯培养和菌剂规模化生产的有效途径。冉海燕（2016）前期研究表明，盾巨孢囊霉属（Scutellospora）可与发根农杆菌A4诱导的烟草毛状根建立了共生体系，并产生新孢子;幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）可与发根农杆菌C58C1和A4诱导的烟草毛状根建立共生体系（卢锡锋，2020），实现了毛状根AM真菌双重培养。毛状根生长状况、培养基成分、外源物质、pH、温度等都会影响双重培养体系中AM真菌孢子的生长（冉海燕，2016;卢锡锋，2020）。

作为寄主的毛状根的生长状况，对AM真菌的连续大规模生产具有重要意义，毛状根生长不良会限制AM真菌生长发育。影响毛状根生长的因素（培养基、pH、光照、温度等）中，培养基中的蔗糖为毛状根的生长提供适宜的能量和能源，是影响毛状根生长的决定性因素（刘高等，2007），是双重培养体系中培养基的关键组分（Bécard & Fortin，1988），蔗糖浓度对毛状根的生长和孢子的发育均有显著影响（Mohan et al.，2017）。

在离体组织培养过程中，碳源可作为底物为植物生长提供能量（Staikidou et al.，2005），并调节培养基溶液渗透压（Neto & Otoni，2003）。蔗糖是最常用的碳源，是培养基组成成分中的关键因子（田翠婷等，2007），在植物体细胞组织培养中，蔗糖一直作为标准碳源（丁世萍等，1998），大多数合成培养基均以蔗糖作为唯一的碳源（刘冬云等，2005），但要注意使用浓度。吕芝香（1981）的观点是，在植物组织培养中最适宜的蔗糖浓度为20～40 g·L1。也有研究证明，培养基中蔗糖为30 g·L1时石斛毛状根（李凤华等，2004）、三裂叶野葛毛状根（何含杰等，2005）和金铁锁毛状根（刘兴斌等，2018）生长最快;使用组合碳源（20 g·L1蔗糖和30 g·L1葡萄糖）最有利于水母雪莲毛状根生长（杨睿等，2005）。在毕银丽等（1999，2000）的研究中，用发根农杆菌A4诱导胡萝卜产生毛状根与球状巨孢囊霉（Gigaspora margarita）和根内根孢囊霉 （Rhizophagus intraradices） 建立双重培养体系

采用含蔗糖10 g·L1的M培养基;在赵长竹（2005）的研究中，发根农杆菌A4诱导的柠檬毛状根与Gigaspora margarita和摩西球囊霉（Glomus mosseae）建立双重培养，110MS培养基含10 g·L1蔗糖毛状根生长最好。邢晓科等（2003）建立地斗管囊霉（Funneliformis geosporum）与胡萝卜毛状根双重培养体系和曹玲（2009）用发根农杆菌K599诱导紫云英毛状根与Gigaspora margarita和玫瑰红巨孢囊霉（Gi. rosea）建立双重培养体系，MSR培养基中蔗糖都是10 g·L1。Srinivasan等（2014）建立了胡萝卜毛状根与异形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）双重培养体系，发现在培养70 d后，产孢率更高，分析其原因可能与培养基中蔗糖含量降低有关，认为产孢率取决于培养基中的蔗糖浓度，不添加蔗糖的培养基产孢量更多;D′Souza等（2013）在研究根孢囊霉孢子体外萌发时也发现了类似的趋势，无蔗糖更利于孢子萌发。Mohan等（2017）建立了胡萝卜毛状根与根孢囊霉双重培养体系，发现10 g·L1蔗糖浓度最利于根系定殖，定殖率随蔗糖浓度的增加而显著降低，但是蔗糖浓度为20 g·L1和30 g·L1时新生孢子数大于10 g·L1。目前，在AM真菌纯培养的研究中，诱导毛状根的材料大多数选用胡萝卜，也有选用柠檬（赵长竹，2005）、紫云英（曹玲，2009）、土豆（Puri & Adholeya，2013）等，而选用烟草的少见报道，且未有研究者探讨过使用烟草诱导毛状根与AM真菌孢子建立双重培养体系时，培养基中适宜毛状根生长的蔗糖浓度，我们后续将进一步完善烟草毛状根AM真菌双重培养体系，这就必须先建立生长状况良好的毛状根培养体系。

本研究结果表明，在30 g·L1蔗糖浓度下使用发根农杆菌C58C1诱导叶片均可长出毛状根，只是对两种烟草的诱导率有所不同：对NC82（87.3%）的诱导率更高，是对Va116（38.6%）的2.26倍，这表明不同基因型材料会影响毛状根的诱导，此结果与李锦锦等（2012）的研究相符。李润田等（2020）的研究表明30 g·L1蔗糖浓度下西洋参不定根诱导率高于15 g·L1和40 g·L1，本研究结果表明30 g·L1的蔗糖浓度对于诱导烟草毛状根同样适用。NC82和Va116的毛状根分枝数量随培养时间而增加，增加量因蔗糖浓度而异;蔗糖浓度显著影响NC82和Va116的毛状根分枝数量，因烟草品种和起始分枝数而异，毛状根分枝增长的抑制蔗糖浓度分别为25 g·L1和15 g·L1。蔗糖浓度对毛状根F（D）W的影响因烟草品种而异，NC82的毛状根在25 g·L1时F（D）W最高0.541 g（0.055 g）;而Va116的毛状根在15 g·L1时最高，分别为0.474 g（0.050 g）。因此，综合分枝数、F（D）W、毛状根生长势考虑，进一步确定了NC82的毛状根最优生长蔗糖浓度为25 g·L1，Va116的毛状根最优生长蔗糖浓度为15 g·L1。

良好的毛状根培养体系是成功建立双重培养体系的关键。本研究优化了NC82和Va116两种烟草毛状根培养基组分配比，为毛狀根大量扩繁奠定基础，为后期烟草毛状根AM真菌双重培养体系的建立奠定了良好的基础，也为其他植物材料诱导毛状根提供参考。

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（责任编辑李莉）

收稿日期：2021-02-09

基金项目：国家科技支撑计划项目 （2015BAD04B0204）

第一作者： 向润（1996-），硕士，研究方向为菌根生物学，（Email）2141700255@qq.com。

通信作者：江龙，博士，教授，研究方向为植物生理学、菌根生物学，（Email）ljiang@gzu.edu.cn。