下调miR-572抑制人胃癌细胞株凋亡、迁移和侵袭机制的实验研究

郭殿华，程 芃，陈卿奇，程 正(海南西部中心医院,海南儋州 571756)

随着早期诊断和治疗技术的不断发展，胃癌相关的病死率有了大幅下降，但胃癌仍然是全球最常见的癌症之一，严重威胁着人类的健康[1]。近年研究发现，微小核糖核酸 (miRNAs) 在癌症的发生发展中参与了诸多生理病理过程，包括如细胞凋亡、细胞增殖、侵袭等[2]。miRNA是内源性非编码核糖核酸（non-coding ribonucleic acid，RNA），有大约20个碱基，通过转录后靶向结合信使RNA（messenger RNA，mRNA）的 3’端非编码区（untranslated regions，UTR）发挥负向调控基因表达的功能[3]。研究表明miR-572是调控细胞发育、凋亡的重要分子，与多种人类癌症的发生发展有关，有望成为癌症治疗的潜在靶点和早期诊断的生物标记物[4]。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因 (phosphatase and tensin hmmlogydeleted on ten,PTEN) 是调节细胞凋亡、代谢、细胞增殖和细胞生长等多种生物过程的重要分子，其具有磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3) 磷酸酶活性，因而可以负向调控蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)通路[5]。大量研究表明PTEN突变可以诱发癌变，被认为是抑癌基因[6]。但miR-572是否能够通过PTEN/Akt2信号通路调控胃癌细胞的存活及恶变尚不清楚，因此本研究使用胃癌细胞株探索下调miR-572对PTEN/Akt2信号通路的影响，以及对胃癌细胞凋亡、迁移的干预机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 正常胃上皮细胞系GES-1与胃癌细胞系HGC-27，AGS，SGC-7901细胞均购自中国科学院细胞库。

1.2 仪器与试剂 杜氏改良Eagle培养液(DMEM)，胎牛血清，胰蛋白酶（Gibco，美国)；转染试剂Lipofectamine2000，Trizol试剂（Invitrogen，美国）；反转录qPCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；miR-572特异寡核苷酸抑制剂（miR-572 inhibitor）及其阴性对照（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）；CCK8检测试剂盒（日本同仁化学），细胞凋亡试剂盒（Invitrogen，美国），TranswelI小室(Corning，美国)。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组：用含有10g/dl FBS 的DMEM培养液培养GES-1，HGC-27，AGS和SGC-7901细胞，当细胞汇合率达80%～90%时进行传代培养。将细胞接种于6孔细胞培养板，培养24 h后进行转染，根据转染试剂盒说明书分别转染miR-572 inhibitor或阴性对照，转染6 h后更换为DMEM完全培养液，继续培养48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.2 qPCR检测细胞中miR-572，PTEN和AKT2的表达水平：收集GES-1，HGC-27，SGC-7901和AGS细胞，以及转染后的AGS细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA，Nanodrop测定RNA浓度后使用反转录试剂盒合成cDNA，并进行PCR扩增。95 ℃预变性10 min，95 ℃变性12 s，55℃～65℃退火10 s，共35个循环。PTEN，AKT2以GAPDH为内参，采用2-△△Ct相对定量法计算各个指标的相对表达量。qPCR引物见表1。

表1 qPCR引物

1.3.3 CCK-8法测定细胞活力：收集miR-572抑制剂组、对照组对数生长期的细胞，消化后接种于96孔板培养，分别于24 h，48 h 和72 h 加入CCK-8试剂。孵育30min后检测450 nm 处A值。

1.3.4 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力：收集miR-572抑制剂组、对照组细胞，无血清培养，取100 μl接种于Transwell小室上层，培养24 h 后用结晶紫染色，显微镜下拍照并计数。侵袭实验：在Transwell小室上层加入基质胶，其余同迁移操作。

1.3.5 流式细胞术检测凋亡细胞比例：实验过程严格按照试剂盒说明书进行（FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI，Biolegend公司，美国）。收集miR-572抑制剂组、对照组细胞，1 000 r/min离心6 min，PBS洗涤2次。每个5ml流式管中加入1×106个细胞，用预冷的cell staining buffer洗涤2次，AnnexinV结合缓冲液重悬细胞，每管细胞中加入5μl FITC AnnexinV溶液和5μl PI染色溶液，轻轻混合后于室温暗处孵育15 min。最后加入400μl AnnexinV结合缓冲液，进行流式细胞仪检测。

1.4 统计学分析 采用SPSS 27.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示。组内和组间进行两两比较时，若满足正态分布且方差齐性采用Student’st检验；若服从正态分布但方差不齐，则用Welch’st-test；若非正态分布，则用Mann-WhitneyUtest，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-572，PTEN，AKT2在不同细胞株中的表达 见表2。PCR检测不同细胞株中miR-572，PTEN，AKT2的表达量。结果表明与正常细胞株GES-1相比，HGC-27，AGS和SGC-7901胃癌细胞株中的miR-572（t=1.411～44.087）和AKT2（t=1.328～26.911）表达量均增高，而PTEN的相对表达量均降低（t=1.504～3.197），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。以AGS细胞变化最为显著，因此本研究选取AGS细胞进行后续实验。

表2 miR-572，PTEN，AKT2在不同细胞株中的表达量

2.2 下调miR-572对胃癌细胞增殖的影响 CCK8检测下调miR-572结果表明，与对照组相比加入miR-572 抑制剂后，AGS细胞株的细胞活力在24 h，48 h，72 h均下降，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；且细胞活力随时间延长逐渐降低（P＜0.05）。而对照组细胞活力各个时间点无明显变化。

2.3 下调miR-572对胃癌细胞迁移和侵袭的影响见图1。Transwell实验检测胃癌细胞的迁徙与侵袭能力。与对照组相比，miR-572 抑制剂组的迁徙和侵袭能力均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 下调miR-572对胃癌细胞迁移和侵袭的影响（40×）

2.4 下调miR-572对胃癌细胞凋亡的影响 见图2。流式细胞术检测不同组凋亡细胞数量，结果显示miR-572 抑制剂组的凋亡细胞比例均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 下调miR-572对胃癌细胞凋亡的影响

2.5 下调miR-572对PTEN，AKT2表达的影响PCR检测不同组miR-572，PTEN和AKT2的表达量，结果显示，与对照组相比，miR-572抑制剂组 的miR-572（0.51±0.12 vs 1.01±0.09）和AKT2（0.43±0.09 vs 1.01±0.11）的表达量降低，而PTEN的表达量升高（3.29±0.14 vs 1.02±0.08），差异均具有统计学意义（t=12.21, 6.87, 23.76, 均P＜0.05）。

3 讨论

胃癌是世界上最常见和最致命的肿瘤之一[7]。全球每年约超过950 000个新增病例。近年来，随着肠镜和外科技术的发展，早期胃癌的5年死亡率显著降低[8]。然而，对于晚期胃癌，5年死亡率仍为30%～50%[9]。胃癌给患者及社会带来了沉重的负担，因此急需从流行病学、病理学、分子机制等方面进行深入探索，以寻找新的治疗策略。

已经有大量文献报道了miRNA在肿瘤的发生、进展、转移中发挥了重要的作用[10]。miRNA是高度保守的非编码RNA序列，长度通常为18～24个核苷酸[11]。miRNA编码基因首由RNA聚合酶转录为pri-miRNA，后在细胞核中由Drosha和DGCR8酶加工后剪切为pre-miRNA，最后在细胞质中被加工成为成熟的miRNA[12]。成熟的miRNA与Ago蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex，RISC)，能特异识别靶基因mRNA的5＇UTR，ORF 或 3’UTR区域以抑制其翻译或诱导其降解[13]。以往的研究已经报道了miR-572在多种肿瘤中的异常表达，如ZHANG 等[14]发现miR-572在人卵巢癌细胞系和癌组织中表达增加，其可通过靶向细胞因子信号抑制物（Suppressor of cytokine signaling，SOCS）1和蛋白p21 促进卵巢癌的发生和进展。ZANG等[15]研究发现在前列腺癌中，miR-572的升高可以促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，并可用来预测肿瘤细胞对多西他赛的耐药性。已有文献报道，在胃癌中miR-572高表达，且靶向负调控含 WW 域的氧化还原酶(WW Domain-containing Oxidoreductase, WWOX)，从而促进胃癌细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡[16]。因此，miR-572可能是一个促癌的分子，并有望成为胃癌治疗的靶点，但目前尚缺乏针对miR-572促癌机制的研究。本研究结果表明，相比正常胃上皮细胞，不同的胃癌细胞株中的miR-572表达均升高，而下调miR-572的水平可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，促进胃癌细胞的凋亡。

为进一步探究miR-572促进胃癌发生发展的机制，本研究检测了PTEN/AKT2信号通路的变化。PTEN 是人类癌症中最常发生突变的抑癌基因之一，在体细胞癌中，如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤，已经发现了PTEN包括一系列失活突变形式，包括错义和无义突变、基因组位点的单或双等位基因缺失、启动子甲基化沉默，或靶向的microRNA高表达等[17]。PTEN失活通常与PI3K/Akt通路的活跃状态相关，PTEN具有磷酸酶活性，可以使PI3K去磷酸化而负向调控Akt通路[18]。另一方面，AKT通路是调控细胞存活和增殖的关键，被发现在多种癌症中发生过度表达或激活，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌[19]。AKT家族包括AKT1，AKT2和AKT3三个成员，其中AKT1和AKT2在人类器官中广泛表达，而AKT3主要表达于脑组织中[20]。此外，AKT2在多种肿瘤，包括胃癌组织中异常表达，且与肿瘤细胞的代谢、增殖、存活、转移、血管生成和耐药性关系更为密切[21]。本研究的结果表明，不同胃癌细胞株的PTEN表达量下降而AKT2表达增高，说明抑癌分子受到抑制，而促癌分子激活；下调miR-572后，抑癌因子PTEN的表达量得到恢复，且胃癌细胞株的侵袭和迁移能力下降，凋亡细胞比例减少，也佐证了miR-572为促癌分子。以往的研究数据表明，miR-572可以与PTEN mRNA的3’UTR区结合，从而介导其转录后沉默，下调细胞内PTEN的水平，这从分子水平解释了下调miR-572能够抑制胃癌进展的原因。

综上，本研究表明下调miR-572能够抑制胃癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，促进其发生凋亡，其作用机制与PTEN/Akt2通路有关，为临床研究提供了细胞层面的证据。但胃癌发生机制复杂，参与的信号通路众多。因此miR-572促进胃癌发生发展的机制需要进一步的探索。