Fib及GP IIb/IIIa基因多态性与家族聚集性LAA脑梗死的相关性

康 慧 王燕华 高 敏 张敬军

山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东 济南 250017

大动脉粥样硬化性（large-artery atherosclerosis，LAA）脑梗死发病机制尚未完全阐明，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是其重要病理生理机制，部分LAA 脑梗死患者具有家族聚集性［1-3］。纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）升高是促进AS发病的一个重要因素，Fib与血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅱb/Ⅲa受体结合，是血小板活化的最后共同通路，并且是血小板聚集过程的关键因素，与许多血栓形成性疾病有密切关系。目前国内外多项研究证实，Fib及GP Ⅱb/Ⅲa存在多种基因多态性，该基因多态性与血小板相关血栓形成密切相关。本研究拟通过病例对照研究，探讨家族聚集性LAA脑梗死、散发性LAA脑梗死及对照组 Fib、GP Ⅱb/Ⅲa 基因多态性，为揭示家族聚集性LAA脑梗死的发病机制及分层防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择在山东第一医科大学第二附属医院神经内科治疗的家族聚集性LAA 脑梗死患者25 例及散发性LAA 脑梗死患者25 例为家族组及散发组。按照家族聚集性LAA 脑梗死及散发性LAA 脑梗死的诊断标准严格入选所有患者。选择25 例与LAA 脑梗死患者同期就诊于同一医院其他科室的非心脑血管病患者作为对照组。家族组25 例，其中男性14例，女性11例，平均年龄（61.28±8.41）岁；散发组 25 例，其中男性 13 例，女性 12 例，平均年龄（61.48± 9.99）岁；对照组25例，其中男性13例，女性12 例，平均年龄（62.92 ± 8.21）岁。3 组患者在年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史等方面差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 诊断标准

脑梗死诊断标准：（1）中老年患者多见，病前常有AS及高血压病等基础疾病病史；（2）发病前可有短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）前驱症状如乏力、肢体感觉异常等；（3）静息状态下或睡眠中急性起病，出现局灶性神经功能缺损症状或体征；（4）局灶性体征常于几小时或1～2 d达到高峰，24 h内神经缺损症状无缓解；（5）患者一般意识清楚；（6）早期行CT检查多正常，颅脑MRI早期可显示责任缺血灶。

LAA脑梗死诊断标准：要求血管影像学检查证实与脑梗死神经功能缺损相对应的颅内外大动脉狭窄>50%或闭塞，且病变血管符合AS 改变；或存在颅内外大动脉狭窄>50%或闭塞的间接证据，如影像学（MRI 或CT）显示大脑皮质、小脑、脑干或皮质下梗死灶的直径>1.5 cm，临床表现主要为皮质损害体征，如失语、体象障碍、意识改变，或有小脑、脑干损害体征。要求有至少1 个以上AS 卒中危险因素（如高龄、高血脂、高血压等）或系统性AS（如冠心病、动脉硬化斑块等）证据［4］。

家族聚集性LAA脑梗死诊断标准：一级亲属至少有2例或2例以上患LAA脑梗死；若存在多例脑血管病患者，则75%以上的患者为LAA脑梗死患者。

1.3 排除标准

年龄小于40 岁或大于75 岁，为汉族以外的民族；不符合家族聚集性LAA 脑梗死诊断标准；心电图示心房纤颤，或既往有心律失常、急性心肌梗死等严重心血管疾病；其他少见病因（动脉炎、脑淀粉样血管病、烟雾病、颅内外夹层动脉瘤）引起的脑血栓形成；既往有周围血管疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病者；既往有严重肝肾功能不全、恶性肿瘤疾病者；近期服用抗血栓药物；严重精神障碍或临床资料不完整者。

1.4 方法

1.4.1 血样采集

所有研究对象在生命体征平稳、清晨、空腹状态（禁食12 h后）下使用EDTA真空抗凝管抽取肘静脉血约2 mL，将抗凝管上下颠倒混匀5～8次，在室温下静置2 h 后保存于−80 ℃冰箱中。75 例血液标本采集完毕后统一进行实验操作，注意避免反复冻融。若标本发生溶血则会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

1.4.2 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

从血液中提取DNA并测定其浓度，置于−80 ℃冰箱中保存备用。PCR 扩增反应体系（100µL）：10×PCR buffer 10µL，正向引物F 2µL，反向引物R 2µL，dNTPs 1.5µL，荧光探针1µL，Taq酶0.5µL，DNA模板1 µL。反应条件：94 ℃预变性3 min，然后按94 ℃30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s每2个循环减0.5 ℃，共20个循环，再按94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s共20个循环，最后72 ℃延长至10 min。

Fib基因正向引物序列：5′-GGCTTGTGGGAAAT GAAGGAAAAT-3′，反向引物序列：5′-GGAAGTTAGG GCACTCCTCAAAGA-3′，扩增目的片段长度 218 bp。GPIIb基因正向引物序列：5′-CTCAAGGTAAGAGCTGG GTGGAAGAAAGAC-3′，反向引物序列：5′-CTCACTA CGAGAACGGGATCCTGAAGCCTC-3′，扩增目的片段长度253 bp。GP Ⅲa基因正向引物序列：5′-GTCGCC ATAGCTCTGATTGC-3′，反向引物序列：5′-GAGCCGG AGTGCAATCCTCT-3′，扩增目的片段长度239 bp。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0统计软件处理数据。计量资料采用均数 ± 标准差（）表示，3 组间比较用方差分析，采用最小显著差异法（LSD法）进行两两比较；计数资料采用n（%）表示，组间比较采用卡方检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 3组研究对象一般临床资料对比

3组患者在年龄、性别等7个方面，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 3组患者一般临床资料对比［，n（%）］

表1 3组患者一般临床资料对比［，n（%）］

临床资料年龄（岁）男性高血压病史糖尿病史冠心病史吸烟史饮酒史家族组（n=25）61.28±8.41 14（56.0）16（64.0）3（12.0）2（8.0）10（40.0）6（24.0）散发组（n=25）61.48±9.99 13（52.0）15（60.0）3（12.0）1（4.0）8（32.0）6（24.0）对照组（n=25）62.92±8.21 13（52.0）15（60.0）1（4.0）1（4.0）10（40.0）6（24.0）F/χ2 0.25 0.107 0.112 1.261 0.528 0.456<0.001 P 0.875 0.948 0.945 0.532 0.768 0.796>0.999

2.2 Fib及Gp Ⅱb/Ⅲa SNP测序

家族组、散发组及对照组中基因的遗传方法均符合 Hardy-Weinberg 平衡原理。Fib 的 PCR 产物如图 1 所示，GP IIb/IIIa 的 PCR 产物如图 2 所示。SNP测序结果显示，Fib基因第455位基因存在2种基因型，即GG、GA（图3），GP Ⅱb基因第843位胸腺嘧啶（T）被鸟嘌呤（G）取代（图4），GP Ⅲa基因型均为TT型，未发现基因多态性。

图1 Fib基因扩增目的片段

图2 GPⅡb、Ⅲa基因扩增目的片段

图3 Fib基因测序结果

图4 GP Ⅱb基因SNP测序结果

研究结果显示，家族组、散发组及对照组Fib基因型分布比较，Fib基因多态性在3组间差异无统计学意义（P>0.05）；家族组、散发组及对照组均以GG型为主，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。GPⅡb基因型分布比较，家族组以ab基因型为主，其中家族组患者ab 基因型分布频率高于散发组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05），a等位基因与b等位基因之间差异无统计学意义（P>0.05），见表3。GP Ⅲa基因型在家族组、散发组及对照组中比较，均为TT基因型，未发现基因多态性，差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表2 3组患者Fib基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］

表3 3组研究对象GP Ⅱb基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］

表4 3组研究对象GP IIIa基因型分布频率比较［n（%）］

3 讨 论

LAA脑梗死具有高发病率、高致残率及高死亡率等特点，已成为最重要的全球健康问题之一。研究表明，遗传因素是LAA 脑梗死的独立危险因素，通过对一些家系、同胞进行研究发现，遗传因素与LAA脑梗死发病关系密切［5-6］，可定义为家族聚集性LAA 脑梗死。研究发现，Fib 及 GP Ⅱb/Ⅲa 与 LAA脑梗死密切相关［7］。AS 是 LAA 脑梗死中的重要病理基础，血管内皮细胞损伤后导致胶原和组织因子暴露，GP 与胶原结合引起血小板粘附激活，释放血栓素（TXA2）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）等物质，促使GP Ⅱb/Ⅲa 表达增加、发生构象改变及受体结合位点暴露，GP Ⅱb/Ⅲa与Fib、vWF、纤维连接蛋白（Fn）、Vitronectin（Vn）等粘附蛋白结合，最终导致血小板聚集及血栓形成。

Fib是纤维蛋白的前体，当血浆中Fib含量过高时会与GP Ⅱb/Ⅲa 结合，导致血小板聚集，促进血栓形成，从而增加LAA 脑梗死的危险性［8］。本研究主要对家族聚集性LAA 脑梗死患者和散发性LAA脑梗死患者及正常人检测 Fib 基因 B β 链-455 位点多态性，结果显示家族组和散发组Fib GG 基因型19 例，AG 基因型 6 例；对照组 GG 基因型 17 例，AG 基因型 8 例。3 组均无 AA 型，Fib B β 链-455 位点GA 多态性在3 组间差异无统计学意义，提示Fib B β 链-455 位点 GA 多态性与家族聚集性 LAA 脑梗死无关。研究发现，Fib B β 链-455 位点 GA 多态性与血浆Fib 水平和冠心病的发展密切相关［9］。在脑梗死患者的血液中同样检测到高水平的Fib，发现Fib B β链-455位点GA多态性与亚洲人脑梗死的危险性显著相关，是脑梗死发生的危险因素［10］。本研究结果与相关报道研究结果存在一定差异，分析其原因如下：（1）基因多态性与环境因素的协同作用，使某些基因型个体更容易受环境因素的影响，从基因型到表现型其过程相当复杂；（2）Fib B β 链-455位点多态性与种族、人群有关，不同种族之间存在差异；（3）可能与本研究分组方法有关，详细机制待进一步研究。

GP Ⅱb/Ⅲa 介导血小板与纤维蛋白原结合，是血小板聚集的最后通路，GP Ⅱb/Ⅲa 被认为是体内血小板活化状态的标志，与血栓性疾病的发生发展密切相关，是目前抗血小板治疗的主要靶点［11］。Gp Ⅱb/Ⅲa 分布于血小板和巨核细胞中，是血小板膜上分布最广泛的糖蛋白，当GP Ⅱb/Ⅲa基因发生变异时会影响血小板聚集从而影响血栓形成，所以GP Ⅱb/Ⅲa 基因多态性成为研究热点。GP Ⅱb 和GP Ⅲa基因在血小板上以Ca2+依赖性二聚体形式存在，其在复合物状态下才能充分发挥受体功能。

本研究结果显示，家族组患者ab基因型高于散发组及正常组，aa 型及bb 型与脑梗死发病关系不大，提示GP Ⅱb基因多态性可能与家族聚集性LAA脑梗死发生有关，推测其可能在遗传因素作用下，基因突变导致GP表面纤维蛋白原受体的分布密度、形态和功能改变，血小板活化功能随之改变，从而增加血栓性疾病发生的风险。关于GP Ⅱb 基因多态性目前研究较少，研究比较深入的是HPA-3（HPA-3a、HPA-3b），Gp Ⅱb第843个位点发生由T到G的碱基替换。HPA-3a（Baka）在这个位点的基因编码Ⅱe，而 HPA-3b（Bakb）的 等 位 基 因 编 码 Ser［12］。Carter 等［13］研究者应用 PCR-RFLP 方法检测 515 例脑梗死患者和423 例对照者的HPA-3 基因频率，发现两组差异无统计学意义（P>0.5），通过随访死亡病例和存活者，处理了混杂因素后得出结论，HPA-3与脑梗死病死率有关，脑梗死患者携带HPA-3a等位基因者病死率相对较高。研究发现，HPA-3b纯合子基因与年轻女性患脑梗死风险相关，女性高血压病、糖尿病和高同型半胱氨酸血症等患者携带HPA-3b等位基因纯合子患缺血性脑卒中的危险性较高［14］。段淏等［15］的研究表明，GP IIb 的基因多态性与脑梗死的发生相关。但有研究显示，GP Ⅱb HPA-3基因多态性与脑梗死的发病无关。

对于GP Ⅲa基因型，本研究结果与国内部分研究结果相同，GP Ⅲa 基因型在3 组间差异无统计学意义（P>0.05），均为TT 基因型，提示GP Ⅲa 基因多态性与LAA脑梗死发生无关，分析其原因可能如下：（1）基因多态性为基因型，血栓形成为表现型，基因发挥作用受环境等多种因素影响；（2）GP Ⅲa基因可能与急性心肌梗死其他高危等位基因位点之间存在连锁关系。目前已发现GP Ⅲa的多态性有6种，在临床中研究最为深入广泛的是HPA-1a和HPA-1b（即PIA1和PIA2），GP Ⅲa基因第2外显子1565位的T取代C，导致第33位点处亮氨酸（HPA-la，PlA1）被脯氨酸（HPA-lb，PlA2）取代。关于GP Ⅲa的基因多态性研究意见尚未一致，Todinova等［16］研究表明，携带PlA2等位基因与脑梗死的发生有关，其通过调节血小板细胞膜弹性、形态及活化状态而促进血栓形成。Weiss 等［17］研究发现，GP Ⅲa 基因 P1A1/P1A2多态性与心肌梗死的发生有关，P1A2基因携带者易发生心肌梗死。但 Maguire 等［18］研究发现，GP Ⅲa基因多态性与LAA 脑梗死发生无关。大部分国内研究发现，汉族人群GP Ⅲa基因多态性与LAA脑梗死发生无关。

综上所述，Fib、Gp Ⅱb/Ⅲa 基因多态性与 LAA脑梗死发生发展密切相关，GP Ⅱb基因多态性与家族聚集性LAA脑梗死的发生有关，其可能通过增强血小板的活化功能从而促进血栓形成，增加家族聚集性LAA脑梗死发生风险，其研究结果有待进一步分析，以期为脑血管病的分层防治提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突