月见草油对蛛网膜下腔出血大鼠EGFR/STAT3通路及运动功能的影响

罗贵聪，任建伟，林奋杰，罗嘉威

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是主要由动静脉畸形出血、动脉瘤破裂等导致的常见脑血管疾病，目前在我国的发病率为每年6/10万～10.5/10万，致残率、致死率较高[1]。研究发现，SAH发生后，氧合血红蛋白等毒性产物及坏死细胞释放的内容物会激活脑组织炎性反应，引起神经细胞凋亡，导致神经功能缺陷[2]。有数据显示，60%以上的SAH病人遗留有神经功能障碍后遗症，严重影响病人的日常行动能力[3]。因此，改善SAH后病人的运动功能极为重要。研究发现，神经中枢系统损伤发生时，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在脑组织中的表达水平迅速升高，其可通过磷酸化激活信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路，影响脑损伤后的神经功能恢复[4-5]。Peng等[6]研究显示，GPR30激动剂减弱SAH大鼠神经元凋亡的作用途径与调控原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)/EGFR/STAT3信号通路有关。月见草油是从月见草种子中提炼的油脂，用于动物实验无毒、无副作用，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫调节等各种药理作用[7-8]。Badri等[9]研究发现，月见草油和电刺激相结合的疗法能改善雄性大鼠坐骨神经挤压伤后的神经功能，但目前月见草油在SAH中的作用尚不明确。基于此，本研究应用月见草油对SAH大鼠进行干预，观察大鼠运动功能改变及EGFR/STAT3通路激活情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠60只，体质量190～220 g，购自上海茂生衍生物科技有限公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0004。

1.1.2 主要试剂 月见草油(货号：MB8809)购自上海榕柏生物技术有限公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号：G1120-10)购自上海信帆生物科技有限公司；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(货号：KGA702C200)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；大鼠白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(货号：KET9001、KET9004、KET9007)购自艾美捷科技有限公司；兔源一抗EGFR抗体、STAT3抗体、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗体、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、二抗羊抗兔IgG(货号：ab52894、ab68153、ab76315、ab186930、ab6721)购自Abcam公司。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(型号：Stat Fax-2100)购自美国Awareness公司；光学显微镜(型号：AH-2)购自日本Olympus公司；化学发光成像系统(型号：MG8000)购自美国Thmorgan公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及SAH大鼠模型制备 将大鼠按随机数字表法分为假手术组、SAH组及月见草油低、中、高剂量组，每组12只。SAH组及月见草油低、中、高剂量组大鼠采用颈内动脉穿刺法建立SAH大鼠模型[10]，具体操作为：术前大鼠禁食6 h，按300 mg/kg向大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，以仰卧位固定大鼠，颈部剃毛，皮肤消毒，沿颈部中线剪开皮肤、组织，显露出右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，在距离颈动脉分叉部位5 mm处用血管夹阻断颈外动脉，于血管夹近端将颈外动脉剪开，插入4-0单股尼龙线经由颈内动脉进入颅内，感觉有抵抗感后继续向前推约3 mm，刺穿大脑前动脉与大脑中动脉分叉处，停留15 s后撤回，结扎皮肤并缝合。假手术组大鼠在穿刺线进入颅内有抵抗感时立刻撤回，结扎皮肤并缝合，其余手术步骤与SAH大鼠模型建立步骤相同。手术期间大鼠体温保持在37 ℃。

1.2.2 给药处理 术后30 min，月见草油低、中、高剂量组大鼠分别灌胃135 mg/kg、270 mg/kg、540 mg/kg月见草油[11]，假手术组、SAH组大鼠灌胃等量生理盐水。

1.2.3 大鼠运动神经功能评分 造模成功后24 h，由对分组不知情的实验者，在安静环境中对大鼠5 min内自主活动、前肢对称性、攀笼功能、四肢对称性、躯体感觉功能和触须感觉进行评估。满分18分，评分越低，运动神经功能损伤越严重[12]。

1.2.4 HE染色 大鼠运动神经功能评分结束后，每组取6只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后将大鼠断头处死，冰上取脑。将脑组织置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，冠状切片，切片厚5 μm。将切片脱蜡至水，HE染色，脱水、透明、封片，每张切片在光学显微镜(×400)下随机选取5个视野观察脑组织病理学变化。

1.2.5 TUNEL染色 取上述脑组织切片，脱蜡至水，使用TUNEL试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书步骤进行，每张切片在光学显微镜(×400)下随机选取5个视野观察细胞染色情况，统计阳性细胞百分比(即凋亡率)，计算均值。

1.2.6 ELISA检测脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平 大鼠运动神经功能评分结束后，将每组剩余的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后断头处死，冰上取脑，分成两份。将其中1份脑组织于冰上研磨匀浆，使用ELISA检测试剂盒及酶标仪检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平。

1.2.7 蛋白质印迹法(Western Blot)检测脑组织中EGFR、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平 将另1份脑组织置于冰上研磨匀浆，加裂解液裂解30 min，离心20 min分离上清液，二喹啉甲酸(BCA)法定量，100 ℃加热15 min变性，取适量上清液经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用封闭液封闭1.5 h，放在一抗稀释液(EGFR抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体、GAPDH抗体，1∶1 000)中4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次(每次10 min)，转移至二抗稀释液(羊抗兔IgG，1∶2 000)中室温孵育1 h，电化学发光法(ECL)发光显色，扫描图像，Image J分析蛋白条带灰度，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度的比值。

2 结 果

2.1 月见草油对大鼠运动神经功能评分的影响 与假手术组相比，SAH组大鼠运动神经功能评分明显降低(P<0.05)；与SAH组相比，月见草油低、中、高剂量组大鼠运动神经功能评分均明显升高(P<0.05)；随着月见草油剂量的升高，大鼠运动神经功能评分依次升高(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠运动神经功能评分比较(±s) 单位：分

2.2 月见草油对大鼠脑组织病理学变化的影响 HE染色结果显示，假手术组大鼠大脑皮层神经细胞结构正常、核仁清晰、排列整齐，SAH组大鼠大脑皮层神经细胞坏死严重，表现为细胞核溶解、碎裂或消失，月见草油低、中、高剂量组大鼠大脑皮层神经细胞的形态结构损伤均有不同程度的减轻。详见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理学变化(HE染色，×400)

2.3 月见草油对大鼠脑组织细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示，与假手术组相比，SAH组大鼠脑组织细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与SAH组相比，月见草油低、中、高剂量组大鼠脑组织细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；随着月见草油剂量的升高，大鼠脑组织细胞凋亡率依次降低(P<0.05)。详见图2、表2。

图2 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况(TUNEL染色，×200)

表2 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较(±s) 单位：%

2.4 月见草油对脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响 与假手术组相比，SAH组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高(P<0.05)；与SAH组相比，月见草油低、中、高剂量组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)；随着月见草油剂量的升高，大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较(±s) 单位：pg/mg

2.5 月见草油对脑组织中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响 与假手术组相比，SAH组大鼠脑组织中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与SAH组相比，月见草油低、中、高剂量组大鼠脑组织中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表达均明显降低(P<0.05)；随着月见草油剂量的升高，大鼠脑组织中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表达依次降低(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 各组大鼠脑组织中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况

表4 各组大鼠脑组织中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表达比较(±s)

3 讨 论

SAH是常见的脑血管疾病，损伤机制复杂，会引起早期脑损伤、迟发性脑损伤、脑血管痉挛和全身炎症反应综合征[13]。卢子明等[14]研究认为，早期脑损伤对SAH病人预后有重要影响，而炎症反应是早期脑损伤发生的重要机制。肖刚等[15]研究认为，抑制炎症反应、氧化应激反应可改善SAH大鼠血脑屏障损伤。本研究采用颈内动脉穿刺法建立SAH大鼠模型，结果显示，SAH组大鼠脑组织中产生严重的炎症反应，大脑皮层神经细胞出现坏死迹象，脑组织细胞凋亡率明显升高，大鼠的运动神经功能评分明显降低，提示SAH发生会引起炎症反应及脑神经细胞凋亡，造成脑损伤及运动神经功能减退，这与之前的报道结果[13]一致。SAH致死、致残的主要原因可能是脑血管痉挛和早期脑损伤，但钱达等[16]研究认为，许多药物成功逆转脑血管痉挛后，SAH的预后也没有得到显著改善，改善早期脑损伤会是未来治疗SAH的主要目标之一。Wang等[17]研究发现，改善神经元存活可减轻SAH诱导的早期脑损伤。因此，本研究旨在寻找一种能减轻炎症反应、降低脑细胞凋亡率的药物，以改善SAH大鼠的早期脑损伤及运动神经功能。

月见草油是从月见草种子中提取的油脂，含有人体生长必需及人体不能合成的多种不饱和脂肪酸，能发挥抗炎、抗氧化等作用，具有较高的药用价值，其作为中草药常用于治疗心脑血管疾病[7-8]。本研究结果显示，使用月见草油干预SAH大鼠后，大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显降低，且IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化与月见草油剂量有关，提示月见草油可降低SAH大鼠脑部炎症反应，且随剂量升高其作用增强。同时，使用月见草油后，SAH大鼠大脑皮层神经细胞的形态结构损伤均有不同程度减轻，脑组织细胞凋亡率亦明显降低，提示月见草油可以抑制脑组织细胞凋亡并减轻大脑皮层脑组织损伤，可能与脑部炎症反应减轻有关。以大脑皮层为主的高级中枢是调控运动功能的神经系统。本研究结果也显示，月见草油降低SAH大鼠大脑皮层脑组织损伤后，大鼠运动神经功能评分明显升高，提示月见草油能提高SAH大鼠运动功能，可能与抑制炎症反应、抑制脑组织损伤、抑制脑细胞凋亡有关。

EGFR是一种活性多肽，在上皮、间质及神经组织中广泛表达，能结合配体将STAT3磷酸化激活，进而调控通路下游多个基因转录[18-19]。钱红等[20-21]研究发现，抑制EGFR/STAT3通路可能是miR-7抑制星形胶质细胞活化的主要作用机制，沉默EGFR可通过阻碍STAT3磷酸化抑制星形胶质细胞活化，促进脑损伤后神经功能恢复。庞金伟等[22]研究亦表明，STAT3通路激活可能参与SAH小鼠早期脑损伤的发生发展过程，并可能与调控SAH发生后的早期神经炎症反应有关。本研究结果显示，SAH组大鼠脑组织中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白水平较假手术组明显升高，提示EGFR/STAT3通路参与SAH的发生。使用月见草油干预治疗可降低SAH大鼠脑组织中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表达，并呈剂量依赖性，提示月见草油可抑制EGFR/STAT3通路激活，并初步推测EGFR/STAT3通路激活受到抑制可能是月见草油发挥降低SAH大鼠炎症水平、抑制脑组织损伤、抑制脑细胞凋亡、提高SAH大鼠运动功能等作用的机制之一。

综上所述，月见草油能抑制EGFR/STAT3通路激活，降低炎症水平，抑制脑细胞凋亡及脑组织损伤，恢复大鼠运动功能，可能为临床改善SAH病人预后提供重要的理论参考依据。