新发突变家系植入前遗传学检测的单倍型构建方法探索

徐惠玲，吴正中，付志红，张华坤，范晶，李雪梅

(南方医科大学附属深圳市妇幼保健院，深圳 518048)

在胚胎植入前遗传学检测(PGT)中，一般活检1～2个卵裂期细胞或者5～10个囊胚滋养外胚层细胞用于分析。每个细胞大约只含6 pg DNA，如此少的遗传物质阻碍了下游的基因检测[1-2]。目前的主流方法是将胚胎活检细胞进行全基因组扩增(WGA)，包括多次退火环状循环扩增技术(MALBAC)、多重置换扩增技术(MDA)和简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)等方法，将pg级的遗传物质放大到ng级，然后再进行基因突变的检测[3-4]。但是在WGA的过程中，容易出现等位基因脱扣(ADO)现象，造成误诊[2]，尤其对于显性遗传的突变来说，ADO更是可能直接造成有疾病表型的后代。因此，目前单基因病胚胎植入前遗传学检测(PGT-M)主要采用胚胎WGA产物进行目标变异位点检测结合家系单倍型连锁分析检测策略[5]。常规的家系单倍型连锁分析需要先证者患儿或是其他核心家系成员，而对于致病位点为新发突变且未妊娠过患儿的夫妻，常规的家系连锁分析无法满足检测。

本研究纳入的3个家系均为夫妻一方本身为患者而致病变异在其核心家系未找到来源，经遗传咨询判定为新发突变，且夫妻双方未妊娠过患儿。对于男方为新发突变患者，我们采用了单精子测序技术构建家系单倍型；对于女方为新发突变患者，我们采用了胚胎互推策略进行致病性单倍型的确定，以此探讨不同的单倍型构建方法在新发突变家系中的PGT应用性及有效性。

资料与方法

一、研究对象

选取2019年4月至2021年12月于本生殖医学中心就诊并接受遗传咨询和辅助生殖助孕的患者。共纳入了3对，其中一方为遗传病患者且致病变异未找到来源的夫妇(表1)。家系1中存在突变的为女方，30岁，为双肾多发性复杂性囊肿患者，PKD1基因检测结果发现Exon 37存在c.10838T>C杂合突变。家系2中存在突变的为男方，32岁，出生后即发生溶血性贫血，血红蛋白浓度(HGB) 60～70 g/L，B超提示脾脏肿大，2000年行脾切除术，血涂片显微镜检查疑球形红细胞增多症，基因检测结果为ANK1：c.3641delC，诊断为Ⅰ型球形红细胞增多症。家系3中存在突变的为男方，32岁，8年前逐渐出现耳鸣、眩晕、呕吐、视力障碍，头颅MRI显示双侧桥小脑区结节状病变，与双侧听神经关系紧密，脑干受压和左侧三叉神经受压，诊断为双耳神经纤维瘤，后行颅内纤维瘤切除术，术后双耳听力丧失，基因检测结果为NF2：c.861delC。上述3个家系中疾病的遗传方式均为常染色体显性遗传，3个患者的父母此前在外院均未检测到与患者相同的致病变异，家族中没有相同症状的患者。该3对夫妇要求进行PGT，阻断疾病在下一代的传递。本研究经南方医科大学附属深圳市妇幼保健院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

表1 三个家系患者相关资料

二、研究方法

1.体外受精及囊胚活检：对3个家系女方进行临床控制性促排卵(COH)，注射HCG 36～38 h后进行取卵。通过卵胞浆内单精子注射(ICSI)进行授精，并于授精后15～18 h观察原核，评估受精情况。胚胎在温度为37℃，气体浓度为5%O2、6%CO2和89%N2的条件下采用序贯培养法(G1、G2，Vitrolife，瑞典)进行培养。培养至第3天(D3)下午对透明带进行激光打孔，孔径为10 μm。囊胚观察采用Gardner评级标准[7]。选择D5、D6囊胚腔充分扩张的囊胚用激光法进行活检，具体操作是持卵针控制胚胎，活检针控制远离内细胞团滋养层区域，在孵出区域激光击打使其皱缩，并切割下5～10个滋养层细胞。活检下的细胞用不含Mg2+和Ca2+的 1×PBS 溶液清洗3次后，保存在含有5 μl细胞裂解液的PCR管中。活检后的胚胎均使用玻璃化冷冻试剂盒(VT101，Kitazato，日本)进行冷冻。

2.单精子分离及一代测序分析：家系2和家系3均是男方为新发突变，我们采用单精子测序的方法构建单倍型。对男方新鲜射出的精液进行梯度密度离心后，用PBS稀释至适宜浓度，在显微镜观察下使用口吸管挑取单个精子，放置于含有5 μl裂解液的PCR管中短暂离心，共挑取20～30条精子。分离后的单精子和胚胎活检样本使用MALBAC的方法进行WGA，WGA产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中出现300～2 000 bp弥散条带即为扩增成功。扩增成功后，对胚胎活检样本及单精子WGA产物进行致病变异的一代测序验证。

3.单倍体分析及拷贝数变异(CNV)检测：将3对夫妇外周血DNA样本、活检胚胎细胞及单精子WGA产物进行高通量靶向Panel测序(100X)，在突变位点两端选取有效单核苷酸多态性(SNP)位点进行单倍型分析。家系2和家系3利用单精子及夫妻外周血的靶向测序结果，即可判断男方突变所在的染色体，据此再判断其胚胎致病变异携带状态(图1 A)。家系1中女方为新发突变患者，采用胚胎互推的策略进行检测，将一代测序结果为携带突变的胚胎作为家系“先证者”，结合夫妇及剩余其他胚胎靶向测序结果进行单倍型综合分析，判断胚胎是否携带致病变异(图1 B)。同时，为了避免染色体异常带来的流产、死胎、畸形患儿的出生，除了致病基因的检测以外，我们还对每个活检胚胎进行了CNV的检测，报告范围为大于10 Mb及嵌合比例大于30%的CNVs。

A：家系2和家系3采用的单精子测序构建单体型技术；B：家系1采用的胚胎互推策略构建单倍体型技术；“O”代表野生型位点，“X”代表致病变异位点。

4.胚胎植入及产前诊断：根据基因检测结果，将染色体正常且不携带致病变异的胚胎复苏后移植入子宫，移植后第10天检测患者HCG水平；移植后35 d，B超检测孕囊和胎心，判断是否妊娠。孕中期进行羊水穿刺验证PGT结果的准确性。

结 果

一、胚胎培养及活检情况

3个家系一共获卵61枚，其中有49枚为成熟卵母细胞，这49枚均正常受精，受精率为100%。D3一共有46枚胚胎进行囊胚培养，达到活检标准24枚(表2)，囊胚形成率为52.2%，所有胚胎活检样本均WGA扩增成功，WGA成功率为100%。

表2 家系胚胎培养及活检情况

二、单精子分离及一代测序结果

家系2和家系3各有4份单精子样本扩增成功，均其中2份携带男方致病变异位点，2份检测结果为野生型，其中家系2检测的是单精子的ANK1：c.3641delC位点(图2 A)，家系3检测的是单精子的NF2：c.861delC位点(图2 B)。

A：家系2单精子测序结果；B：家系3单精子测序结果；红框内为突变位点。

三、胚胎基因型及CNV检测结果

3个家系一共检测了24个囊胚(表3)。其中家系1的E1-5及E1-14号胚胎一代测序结果出现了ADO现象，ADO率为8.3%(2/24)，这也进一步验证了进行连锁分析的必要性。CNV的检测结果显示，24个囊胚中20个核型为46，XN的胚胎，整倍体率为83.3%(20/24)；有4个染色体片段拷贝数异常的胚胎，4个均为嵌合体胚胎，嵌合比例为16.7%(4/24)。

表3 三个家系胚胎检测及处理结果

续表

四、胚胎移植及随访结果

3个家系分别移植了1枚不携带致病变异的整倍体胚胎。家系1移植了E1-1号胚胎后第10天，女方β-HCG检测数值为254.52 U/L；移植术后第39天，B超检查可见胎心胎芽；孕19周羊水穿刺检查结果为：46，XN，且不携带PKD1：c.10838T>C变异；孕37周顺产一名2 220 g健康女婴。家系2移植了E2-1号胚胎后第9天，β-HCG检测数值为474.45 U/L；移植术后第31天，B超检查可见胎心胎芽；孕17周羊水穿刺结果为46，XN，且不携带ANK1：c.3641delC致病变异，撰稿时为妊娠第24周。家系3移植了E3-1号胚胎后第9天，β-HCG检测数值为252.03 U/L，孕18周羊水穿刺结果为46，XN，且不携带NF2：c.861delC致病变异，撰稿时为妊娠第20周。

讨 论

PGT-M与产前诊断相结合，从理论上讲能从源头阻止患病胎儿的妊娠，避免了妊娠患病胎儿给孕妇带来的身体伤害、给孕妇家庭及社会带来的沉重负担。目前，针对胚胎活检细胞的WGA方法均存在一定概率的ADO，在单细胞水平，MALBAC扩增的ADO率为4.55%，MDA扩增的ADO率为22.5%，虽然使用5个以上细胞作为起始模板，ADO率会显著下降，但是仍存在误诊的可能[8]。利用突变位点两端的短串联重复序列(STR)或SNP位点进行家系单倍型连锁分析是解决ADO的主流方法，而家系成员的缺失及新发突变无法完成常规的疾病连锁分析。

本研究纳入的3个家系均为新发突变。据报道，新发突变发生概率与父亲母亲年龄、基因组结构、突变类型等因素相关[9-11]。家系1所涉及的常染色体显性多囊肾属于新发突变率较高的一种疾病，该疾病的新发突变率可达10%～15%[12-13]。据估计，父母表型正常的球形红细胞增多症患儿多达50%是由ANK1新发突变所导致[14]。NF2基因突变导致的Ⅱ型神经纤维瘤50%由新发突变导致，剩余患者是从受累的父母中遗传而来[15]。随着PGT-M技术的成熟和应用越来越广泛，如何对携带新发突变夫妻的胚胎进行基因检测，也需要更多的研究和实践。

近年来，已有研究探讨和解决了新发突变及家系成员缺失的单倍型连锁分析。如2021年，Wang等[16]从ADPKD新发突变患者受累胚胎确定了“高危型”和“低危型”的单倍体，当送检胚胎一代测序结果显示无受累胚胎作为“先证者”时，可利用患者单精子或极体测序结果判断胚胎的致病变异携带状态。此外，有学者利用Pacbio第三代长读长测序技术确定了2对携带单基因致病突变夫妇的致病突变所在染色体，再与胚胎SNP位点进行单倍体型分析，从而判断胚胎疾病的携带状态[17]。第三代长读长测序在解读复杂的基因组结构等方面有其优越性，比如可以解决多囊肾疾病中的假基因同源性高的问题，但是其成本较高、通量较小、分辨率较低，目前应用还仅处于科学研究阶段，并未在实际应用中进行推广。还有学者利用10X Genomics技术对2对分别携带地中海贫血以及Norrie疾病突变基因的夫妇，在不依赖先证者以及相关家系成员的情况下，完成了PGT-M的单倍型连锁分析，移植后两对夫妇均获得了健康的后代[18]。但是该种方法在GC含量高、高度重复等复杂基因组区域不能保证单倍型分型成功，此外由于成本较高，适用性受到限制。

本研究针对不同性别携带的新发突变采取了两种单倍型分析策略。家系2、3为男方携带新发突变，我们分离男方单精子进行测序及致病位点的验证，直接分别锁定致病突变及野生型位点所在染色体上下游的SNP基因型，然后再分析胚胎中SNP基因分型就能对胚胎致病性进行判断。由于男性精子数量庞大，因此单倍型构建成功率高，但是操作较为繁琐，分离的单精子有WGA失败的可能。家系1为女方携带新发突变，我们对其胚胎进行相应位点一代测序以及上下游SNP位点的靶向测序，将一代测序结果显示为携带致病变异的胚胎作为“先证者”，与夫妻双方进行单倍型连锁分析，之后分析和验证剩余胚胎的基因型。这种利用胚胎结果互推的策略，需要送检的样本中有携带致病突变的胚胎，当一代测序均未检测出异常胚胎时，需要进行第2次促排或者利用极体进行单倍型分析。但是极体活检存在一定技术难度，极体容易出现碎裂、降解等情况，导致扩增失败。同时并非所有卵母细胞都能受精发育到囊胚阶段，因此，存在无效活检的情况[19]。

综上所述，本研究报道了3例新发突变的家系，包括c.10838T>C导致的常染色体显性多囊肾、ANK1：c.3641delC突变导致的Ⅰ型球形红细胞增多症，以及NF2：c.861delC导致的Ⅱ型神经纤维瘤，后2个变异位点均为国际首次报道，丰富和拓展了相关疾病的遗传图谱。同时针对这3个家系我们采用了突变位点直接检测加上2种不同的单倍体型分析策略，使3个家系均成功妊娠且通过了产前诊断检测，其中1个已分娩未携带亲本致病变异新生儿。实践证明，利用单精子测序技术和胚胎互推策略可以实现携带新发突变的夫妇或是家族成员不全的家系PGT-M的检测。