澳洲坚果MibZIP1基因克隆及表达规律分析

宋海云 张 涛 贺 鹏 郑树芳 王立丰 王文林*

（1. 广西南亚热带农业科学研究所，龙州 532400；2. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101）

澳洲坚果（Macadamia integrifolia）指的是澳大利亚新南威尔士州和昆士兰州的原生植物之一，富含油酸和棕榈酸等不饱和脂肪酸和大量蛋白质、矿物质等生物活性营养物质［1-2］。2020 年，我国澳洲坚果种植面积470 万亩，位居世界第一位，产量位居世界第二位。广西南亚作物科学研究所于1986 年开始引种澳洲坚果试种，已建立种质资源圃100 亩，收集了国内外优良品种、优良单株315 份，并建立示范基地500 亩。我国选育品种主要为‘南亚1 号’［3］，‘桂热1 号’［4］等。我国适宜澳洲坚果种植的地区广阔，各种植区的气候类型明显不同，加之引进的品种在我国种植区的丰产稳产性表现差异较大，同一品种在我国不同的种植区表现也明显不同。国外优良品种离开本土后，其产量及品质都有所降低，主要原因是我国澳洲坚果主要种植地域分布在广西［5］和云南［6］等省区，干旱等非生物胁迫对澳洲坚果产业的发展危害大［7-8］。主要表现在干旱导致澳洲坚果叶片光合活性下降［8］、落花、落果、降低产量。在生理水平上，发现澳洲坚果抗旱与渗透调节有关［9］。在品种选育过程中，发现澳洲坚果品种间干旱抗性间存在显著差异，并发现干旱抗性与叶片形状、叶绿素含量和脱落酸（ABA）含量有关［10］。

植物干旱的信号调节机制与ABA，钙依赖蛋白激酶（CDPKs）和磷脂信号路径有关［11-12］。脱水（干旱）应答元件结合蛋白（DREB）和bZIP 转录因子是抗性相关主要的转录因子家族［13-14］。bZIP 转录因子家族是真核生物特有的转录因子之一，通常根据其bZIP 结构域（包括一个碱性结构域和一个亮氨酸拉链区进行识别［15］。其碱性结构域高度保守，具有N-x7-R/K 不变区域，而亮氨酸拉链由亮氨酸或其他大的疏水氨基酸（异亮氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等）的几个重复序列组成，并且恰好有9 个氨基酸残基排列在碱性结构域的末端［16］，参与植物抗逆等过程［14］，通过ABA 信号途径关键成员PP2C 等响应植物逆境胁迫［17］。其机制为ABA 诱导PP2C 与受体蛋白相互作用，抑制PP2C 蛋白磷酸化，使得SnRK2 处于激活状态，触发下游ABA 应答元件（ABA-responsive element，ABRE）与bZIP 转录因子结合，从而调控下游靶基因的表达［18］。bZIP 单体是长α螺旋，通过碱性结构域结合特定的DNA 序列，并通过亮氨酸拉链相互作用，介导二聚形成重叠的螺旋状结构［19］。这种结构影响目标基因的结合特性、表达多样性和基因调控［20］。根据结构域之间的差异可将bZIP基因家族分为多个亚族［21］。目前，拟南芥（Arabidopsis thaliana）［22］、木薯（Manihot esculenta）［23］、烟草（Nicotiana tabacum）［24］等植物的bZIP 转录因子家族已被鉴定。拟南芥和木薯的bZIP 转录因子基因家族被分为10 个亚族。然而，澳洲坚果中尚无bZIP 基因家族成员结构与功能的相关研究报道。据此，本研究从‘桂热1 号’品种的果实中克隆bZIP基因，利用生物信息学对其结构和功能进行预测分析，还做了其在不同品种、组织和激素处理后的表达规律分析，用于鉴定其功能。鉴于在澳洲坚果产业中面临的干旱逆境和生产中采用激素作为主要产量和品质调节剂的现状，鉴定并揭示澳洲坚果中的bZIP 家族成员的结构与功能将为澳洲坚果产业的发展提供技术指导。本研究结果既可为植物bZIP 转录因子功能研究提供理论参考，也可为生产中研发新型产量调节剂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘桂热1号’和‘695’品种种植在广西南亚热带农业科学研究所澳洲坚果种质圃。基因克隆和表达分析所需大肠杆菌（Escherichia coli）感受态由本实验室保存。反转录试剂盒，Phanta 高保真酶、ClonEXpress 试剂盒、第二代TOPO 克隆试剂盒均购自大连TaKaRa公司和南京诺唯赞公司。取1年生高度在1 m 左右的澳洲坚果‘桂热1 号’芽接苗上，分别喷施6 mmol·L-1赤霉素（GA3）、2 mg·L-1玉米素（ZT）、6 mmol·L-1水杨酸（SA）、2%乙烯利（ETH）、300 μmol·L-1ABA 和2%过氧化氢（H2O2）、这些药剂均使用0.1%的乙醇水溶液进行溶解，对照组植株喷施0.1%乙醇水溶液，直至叶片上溶液成珠下滴即可停止喷施。采样时间分别是0、0.5、2、6、10、24 h，用于荧光定量分析。

1.2 试验方法

1.2.1 提取总RNA和cDNA合成

澳洲坚果果实、叶片、花和枝条RNA 的提取、反转录及浓度测定参考王文林等的方法［25］。将提取的RNA 及反转录获得的cDNA，配制1%琼脂糖凝胶并进行电泳检测。

1.2.2 克隆MibZIP1全长

MibZIP1基因扩增引物、荧光定量分析引物和内参基因引物序列见表1。引物序列由广州英浚生物公司合成。基因克隆方法参考王文林等［25］方法。

表1 MibZIP1 基因扩增引物、荧光定量分析引物和内参基因引物序列Table 1 MibZIP1 gene amplification primer，fluorescence quantitative analysis primer and reference gene primer sequences

1.2.3 MibZIP1生物信息学分析

对MibZIP1-ORF 进行生物信息学预测分析。利 用ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）工 具 和DNAMAN8.0（Lynnon Corporation，USA）寻找最长的开放阅读框和完成氨基酸序列的翻译；利用在线分析工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、TMPred（https：//embnet.vital-it. ch/software/TMPRED_form. html）、PSIPRED V4.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）、SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析理化性质、跨膜结构、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点、聚类分析。利用PlantmPLoc（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plantmulti/）、Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、DNAMAN 多序列比对工具分析亚细胞定位、启动子、多序列比对。

1.2.4 MibZIP1表达规律分析

用前期处理得到的cDNA 作为模板，以MiACTIN为内参基因和相应的荧光定量引物，美国Biorad（伯乐）生产的CFX96 Touch™Real-TimePCR System 荧光定量PCR 仪中进行荧光定量PCR 反应，每个材料进行3 次生物学重复和3 次技术重复。荧光定量PCR 反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s扩增40个循环，分析MibZIP1在不同组织、激素和过氧化氢处理下的表达情况，并使用2-ΔΔCt方法分析处理荧光定量数据。

1.3 数据分析

采用origin2018 科技绘图软件和office365 进行数据整理。所有基因表达试验数据均为3 次生物重复和3 次技术重复的平均值和标准误。采用SPSS 26 对数据进行单因素方差分析和多重比较，分析显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 MibZIP1基因和编码蛋白理化性质分析

以澳洲坚果‘桂热1号’品种果实的cDNA为模板，采用RT-PCR 技术扩增MibZIP1。测序验证后，将cDNA 序列命名为MibZIP1。MibZIP1基因长度为1158bp，包含927bp编码区，共308个氨基酸。MibZIP1蛋白质的理化性质如下：分子式C1503H2409N421O498S18，总原子数4 849，分子质量为34 922.26 Da，等电点4.63，总平均亲水性为-0.586，带正电残基总数（Arg+Lys）为59，带负电荷残基总数（Asp+Glu）为38，不稳定系数为62.90，说明该蛋白属于不稳定蛋白，脂肪族氨基酸指数是80.39，推测MibZIP1蛋白是一个不稳定的亲水蛋白。其与蒂罗花TsbZIP60（Telopea speciosissima，XP_043707929.1）；荷花NnbZIP60（Nelumbo nucifera，XP_010270593.1）；葡萄VvbZIP60（Vitis vinifera，XP_003634336.3）；山核桃CibZIP60（Carya illinoinensis，XP_042991655.1）；胡桃 木JrbZIP60L（Juglans regia，XP_018832980.1）（见图1）。蛋白相似性达61.1%。说明MibZIP1是植物bZIP转录因子家族的一员。

图1 MibZIP1与其他物种bZIP转录因子的序列澳洲坚果MibZIP1（Macadamia integrifolia，XM_042651577.1）；蒂罗花TsbZIP60（Telopea speciosissima，XP_043707929.1）；荷花NnbZIP60（Nelumbo nucifera，XP_010270593.1）；葡萄VvbZIP60（Vitis vinifera，XP_003634336.3）；山核桃CibZIP60（Carya illinoinensis，XP_042991655.1）；胡桃木JrbZIP60L（Juglans regia，XP_018832980.1）Fig.1 Sequence alignment analysis of MibZIP1 and bZIP transcription factors in other species MibZIP1（Macadamia integrifolia，XM_042651577.1）；TsbZIP60（Telopea speciosissima，XP_043707929.1）；NnbZIP60（Nelumbo nucifera，XP_010270593.1）；Grape VvbZIP60（Vitis Vinifera，XP_003634333.3）；CibZIP60（Carya illinoinensis，XP_042991655.1）；Walnut JrbZIP60L（Juglans regia，XP_018832980.1）

2.2 MibZIP1蛋白结构分析、跨膜结构及亚细胞定位预测

从图2A 中可以看出，MibZIP1 从172～230 aa为bZIP superfamily 结构域。MibZIP1 蛋白二级结构中α螺旋占72.86%，延长链占8.44%，β折叠占1.95%，无规卷曲占46.75（见图2B）。MibZIP1 的三级结构属于典型亮氨酸拉链结构（见图2C）。MibZIP1 蛋白在213～235 aa 具有跨膜结构，在58～79 aa SWMDELEELLMKDDTESCVNPE 处具有核定位信号，概率为95.2%。可见MibZIP1 编码一个有跨膜结构的转录因子蛋白。

图2 MibZIP1序列结构A.保守结构域；B.二级结构；C.三级结构模型Fig.2 Structural analysis of MibZIP1 A.Conserved domain；B.Secondary structure；C.Tertiary structure

2.3 MibZIP1蛋白系统进化分析和motif分析

系统进化分析澳洲坚果MibZIP1 与蒂罗花和荷花的bZIP60 基因相似性最高，推测MibZIP1 与植物bZIP60 蛋白具有相似的功能（见图3A）。利用TBtools 中的MEME 工具分析澳洲坚果MibZIP1与其在NCBI数据库中比对亲缘性较高的MibZIP1蛋白序列，预测出4 个motif 基序（见图3B）。研究表明，bZIP60 转录因子主要参与抗逆反应［26］和调控脂肪酸合成［27］。

图3 MibZIP1的motif分析A.16个物种bZIP聚类和motif分析；B.4个保守的motif序列Fig.3 Motif analysis of MibZIP1 A.Multiple protein sequence alignment and motifs of 16 species bZIP；B.The sequences of four motifs

2.4 MibZIP1基因表达模式规律分析

分析‘桂热1号’和‘695’品种澳洲坚果不同组织枝条、花、和叶片表达规律表明，MibZIP1在‘桂热1 号’和‘695’品种的枝片中表达量最高，花中的表达量次之，叶片中表达量最低。如，在‘桂热1 号’中，MibZIP1表达量在枝条是在叶片表达量的41.19 倍，花中是叶片的26.54 倍。在‘695’品种中，MibZIP1主要在枝条中表达最高，枝条中的表达量是叶片的2.24 倍，是花中的7.69 倍（见图4）。

图4 MibZIP1基因在不同品种和组织中的表达分析各柱形图上用不同小写字母标识表示数据间差异极显著（P＜0.05），下同Fig.4 MibZIP1 expression in different varieties and tissues Different lowercase letters above each column means significant at P＜0.05 level，the same as below

通过分析MibZIP1在主要植物激素和H2O2处理下的表达规律发现，生长类激素GA3对MibZIP1表达没有显著的诱导作用（见图5A）。细胞分裂素类激素ZT 显著上调MibZIP1表达，在0.5 h 和10 h 分别上调达41.03 倍和77.17 倍（见图5B）。SA 诱导MibZIP1表达呈现单峰规律，在2 h时上调32.36 倍（见图5C）。成熟和衰老类激素ETH 在早期显著诱导MibZIP1表达，后逐渐下降，在0.5 h表达量为13.8.37倍（见图5D）。逆境激素ABA 在6 h上调MibZIP1表达，达7.68 倍（见图5E）。模拟活性氧的H2O2诱导上调，在2 h和6 h分别为2.26倍、2.62倍（见图5F）。

图5 MibZIP1在不同激素和过氧化氢处理下的表达A.GA3；B.ZT；C.SA；D.ETH；E.ABA；F.H2O2Fig.5 MibZIP1 expression in under different hormones and hydrogen peroxide treatment.A.GA3；B.ZT；C.SA；D.ETH；E.ABA；F.H2O2

3 讨论

澳洲坚果是澳大利亚东部亚热带雨林特有的一种坚果作物，在澳大利亚、南非［28］、夏威夷［29］、巴西、中国等国家都有种植。由于澳洲坚果在我国经常性面临干旱［9］、激素诱导等栽培措施的作用［30］，笔者从澳洲坚果中克隆并鉴定MibZIP1基因并分析了其在不同品种、组织和激素处理条件下表达规律。

首先，从克隆结果看，MibZIP1 是典型的bZIP转录因子。bZIP 结构基序包含一个基本区域和一个亮氨酸拉链，由7 个亮氨酸残基的α螺旋组成，形成具有稳定平行的亮氨酸拉链结构域的二聚体（见图2C）。bZIP 转录因子虽然在序列上保守，却由于二聚化的作用形成多种复杂的转录调控变化。与下游基因启动子区域的G-box基序等结合，在植物抗逆中发挥作用［31］。

其次，bZIP 在不同性状的品种和部位间表达量差异显著。本研究表明，MibZIP1在枝条和叶片中表达量均比‘桂热1号’高，而在与果实性状形成发育相关的花中则显著低于‘桂热1 号’（见图4）。这与2个品种果实性状的关系一致。说明MibZIP1主要在枝条和叶片中起到抗逆作用。为此，本研究以不同激素和过氧化氢处理的叶片深入分析其响应规律。

再者，MibZIP1主要受ZT、SA、ETH 和ABA 诱导上调表达（见图5：B～E）。天然的细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，在N6位置含有类异戊二烯或芳香基团［32］。ZT 存在于2 个异构体，Cis-ZT 和trans-ZT，指的是异戊二烯侧链上末端羟基的位置不同［33］。植物中的ZT 信号能够延缓叶片衰老，促进芽分支，并特别影响植物的茎和根的生长［34］。本研究发现ZT 可显著上调MibZIP1表达（见图5B），说明MibZIP1具有潜在参与枝条等果实发育的过程中。SA 合成是植物应对生物胁迫的主要方式，参与对病虫害的系统性抗性［35］。转录因子NPR1是SA 信号途径的重要转录因子［35］。本研究发现SA 在2 h 显著上调MibZIP1达30 倍 以 上，说明一是SA 直接诱导MibZIP1 转录因子起抗性作用，或是与其他激素信号交互起到调控作用（见图5C）。这是因为研究表明SA 与IAA 信号［36］，ETH 和茉莉酸（JA）［37］，GA 信号［38］通路间均有交互作用。已经鉴定了AtMYB44转录因子等是激素信号交互的关键转录因子［39］。ETH 在调控蔗糖转运［40］、枝条花青素合成［41］和抗病性［42］等多种生物过程具有重要作用。在澳洲坚果栽培研究中，发现其具有促进落果［30，43］和提高品质的影响［44］。本研究发现ETH能够在早期诱导MibZIP1上调达140 倍，说明该基因显著响应ETH 诱导（见图5D）。bZIP 家族的A亚组就是ABA 信号途径的ABF 转录因子，在气孔调控［45］，抗寒［46］、伤害［38］、盐［47］和干旱［48］胁迫等具有重要作用。本研究中发现ABA 显著诱导MibZIP1上调表达到8 倍，结果与结构分析的一致（见图5E）。

4 结论

总之，MibZIP1 在‘桂热1 号’叶片中受ZT、SA、ETH 和ABA 诱导显著上调表达。推测MibZIP1 与澳洲坚果抗逆性和果实发育过程密切相关，并可能参与多种激素信号交互，为阐明其在澳洲坚果激素调控技术研发和果实发育中的功能提供依据。