束花石斛的繁育生物学特性

杨建伟 李宗艳 冯 尧 任书娴 胡梦露 叶松菩

（西南林业大学园林园艺学院，昆明 650224）

石斛属（Dendrobium）全球约1 000 种，我国74种2 变种［1］。束花石斛（Dendrobium chrysanthum）在我国分布于广西西部、贵州南部、云南南部、西藏东南部等地［1］。随着人们对野生石斛资源灭绝性的采挖及对其生境的破坏，野生资源日渐枯竭。国家林业和草原局、农业农村部2021 年第15 号公告中已经将石斛属所有种列入《国家重点保护野生植物名录》，其中，束花石斛被列为国家二级保护植物［2］。我国石斛属资源丰富，花色、花型变异种类多，具有广阔的开发利用前景。束花石斛花色鲜黄、开花数量多、是鲜有的秋季开黄花的石斛种类，具有重要的育种和观赏价值［3］。然而，目前其种质资源开发利用不多，截至2021年底，以该种为亲本的杂交登录品种仅有2个［4］。

繁育特性是兰科（Orchidaceae）植物保育的基础，大部分兰科植物的繁育系统以异交为主，部分自交亲和［5］。与其他兰科种类相比，石斛属植物具有较高的自交不亲和性，Johansen［6］对61个石斛兰原种进行自花授粉试验，发现72%的原种自花授粉后不育。石斛兰自交不亲和种的数量几乎占到兰科植物自交不亲和物种的一半，近年在石斛自交不亲和的形态学、生理学和分子机制研究领域取得一些突破。束花石斛的交配系统属于自交不亲和型（SI），Niu 等［7］调查26 种石斛人工自花和异花授粉结实率，并观察其授粉后花粉管生长表现，发现有4类自交不亲和花粉管生长形态类型，束花石斛自交后花粉管在花柱顶端就停止了生长。进一步的组学分析表明，与蔷薇科（Rosaceae）、茄科（Solanaceae）和车前科（Plantaginaceae）植物SI 的作用机制不同，兰科植物中不存在基于S基因座核酸酶（S-RNase）类型的自交不亲和的同源基因，束花石斛配子体自交不亲和（GSI）不属于S-RNase不亲和型［8-9］。Nilsson［10］基于兰科传粉生物学研究表明，多数兰科植物的结实率低下，石斛属植物在自然情况下结实率低［11］，人工栽培下如何精确授粉，提高束花石斛的结实率，具有现实的生产意义和保育价值。

授粉是否结实取决于物种自交亲和性、花粉活力、柱头可授性和环境条件［12］，准确掌握物种的花粉活力和柱头可授性发育规律，做到精确授粉是提高授粉结实率的关键。有关兰科植物花粉和柱头发育特点研究，目前集中在有较高观赏价值的种类。有报道表明，球花石斛（D. thyrsiflorum）花粉离体萌发率为53.3%［13］；玫瑰石斛（D.crepidatum）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、细茎石斛（D.moniliforme）花粉活力分别可达80.0%、83.5%、84.0%［14］；其他兰科材料中，蝴蝶兰‘天香公主’（Phalaenopsis‘Tianxiang’）花 粉 染 色 率 仅 为33.06%，多花指甲兰（Aerides rosea）和‘绿肉饼’兜兰（Paphiopedilum pacific）花粉活力可达60.0%和59.99%［15-17］。柱头发育成熟关系到花粉的识别和水合过程，兰科植物柱头的黏液基质中含有大量的分泌细胞，研究表明，成熟柱头表面含有的过氧化物酶（POD）、H2O2等影响花粉的识别过程［18］。通常对柱头成熟度的快速诊断依据联苯胺—过氧化氢染色确定［19］，对球花石斛、蝴蝶兰‘天香公主’、‘绿肉饼’兜兰检测后在开花3 d、10～15 d、10～20 d 时，柱头过氧化氢酶活性最大［13，15，17］。目前还没有关于束花石斛花粉活力、柱头可授性变化规律的相关报道，相关研究的开展，能够为其精确授粉提供指导。

本项目通过开展束花石斛开花习性、花粉生活力、柱头分泌特性、柱头可授性、人工授粉特性研究，旨在揭示其繁育基础生物学特性，为其人工科学地授粉和杂交提供合理依据，为其扩繁及资源保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

束花石斛引种于云南保山、西双版纳、德宏，种植于西南林业大学树木园的兰花种质资源圃（25°4′1″N，102°45′56″E，海拔1 947.42 m，年平均温度15.6 ℃），生长状况良好。试验于2021 年4—11 月开展，自然结实的束花石斛蒴果材料来源于保山，果实成熟后取下称量质量，干燥散粉后收集部分进行种子形态观察和种子活力测定，余下在室温干燥环境中贮藏。

1.2 试验方法

1.2.1 开花习性及花器官特性测定

束花石斛花期形态指标和观测方法参照姜艳等的方法［13］，观察来自3 个种源地的植株开花习性，每个种源地以20 株为一个群体，群体花期统计从群体始花期至末花期的时长（见表1）。每种源地随机抽取的10 个束花石斛个体进行形态观测，花数量性状指标包括中萼片、花瓣、唇瓣高宽、子房长度、柱头腔长宽和花粉块长宽。花的质量性状指标包括花色、瓣质、瓣形、有无被毛、合蕊柱和药帽色泽。

表1 束花石斛开花期观测指标及观察方法Table 1 Observation indexes and methods of anthesis of D.chrysanthum

1.2.2 花粉活力检测

采用TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法进行束花石斛花粉活力检测，根据束花石斛单花寿命，花粉活力取样时间分别定为开花第1、2、3、5、7、9、11天，10：00 随机采集5 朵同一开花时间的花粉块作1 个混合样本，重复取样3 次，将样本捣碎后进行染色观察，染色参阅李紫薇等的方法［20］，每个开花时期的花粉制片3 张，每张随机选取5 个视野进行统计。红色花粉计为有活力，不着色或着黄色计为无活力。

花粉活力=有活力的花粉/观察花粉总数×100%

1.2.3 柱头可授性检测

从开花第1 天开始连续观察记录5 个柱头随开花时间延长黏液的分泌情况，在开花第1、2、3、5、7、9、11 天，10：00 随机采取的5 个柱头，进行联苯胺-过氧化氢检测柱头可授性，方法参阅姜艳等［13］的方法，试验重复3次。

1.2.4 人工授粉

在晴天10：00 以后进行人工同株异花和自花授粉，分别进行去雄套袋、在单花开后第4 天进行同一植株同花和异花授粉，授后套袋，每个种群授粉10朵，授粉前后3 d不浇水。授粉后观察花形态变化，若成功授粉，个体2周后花朵形态正常，唇瓣渐萎蔫，子房膨大。

1.2.5 种实发育观测

从保山种源地获得束花石斛成熟蒴果8个，经表面清洁称量质量，在干燥果荚裂开后，取等体积种子混合后进行测定。①种子形态观测：随机选取30 粒种子，使用目镜显微尺测量种子长和宽。②种胚发育程度观察：制片10张，每张片子随机选取5 个视野，统计种子数量和有胚种子数量，种子成胚率=胚发育完整的种子数/观察种子总数×100%。③种子活力测定：TTC 染色检测方法和活力判断方法同上，制片10 张，每张片子随机选取5个视野进行统计，种子生活力=有活力的种子数/观察种子总数×100%。

1.3 数据处理

用Excel 进行种子大小的变异系数和标准差分析。变异系数为标准差与平均值的比值。对花粉活力进行单因素方差分析（ANOVA），若P＜0.05，对相关指标进行Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 束花石斛开花习性及花器官特性

在昆明温室栽培条件下的束花石斛花期为8—10 月，花芽萌动期为19 d，现蕾期为23 d；始花期10 月1 日，盛花期10 月13 日，末花期为10 月29日；单花寿命最长15 d，最短10 d，均值12.4 d；群体花期28 d（见表2）。

表2 束花石斛开花期观测指标结果Table 2 Charcters observed during flowering period of D.chrysanthum

束花石斛于当年生枝条上开花，花与叶对生，1～5 朵单花聚生（见图1A）。花呈鲜黄色；花萼和花瓣质地较厚，光滑呈蜡质；中萼与侧萼大小一致，卵圆形，边缘全缘，先端钝圆起兜（见图1B），萼片高1.9～2.4 cm，宽1.3～1.5 cm（见图1D）。花瓣比萼片稍大，卵圆形，形态与萼片一致，高2.2～2.5 cm，宽1.5～1.8 cm（见图1D）。唇瓣鲜黄色，扁球形，表面背面被毛，唇瓣边缘呈流苏状，瓣基部有两个对生的红棕色卵圆形斑块（见图1B），唇瓣高1.5～1.8 cm，宽1.9～2.2 cm（见图1D）。合蕊柱黄色（见图1C），药帽淡黄色（见图1C），子房长4.5～5.9 cm（图1C）。柱头腔长方形，长3.13 mm，宽3.02 mm，花粉块长2.74 mm，宽2.37 mm，10块花粉块重0.012 g（见图1C）（见表3）。

图1 束花石斛开花枝条和花形态特征A.开花枝条；B.花朵形态；C.蕊柱结构；D.花瓣及萼片；a.左花瓣；b.中萼片；c.右花瓣；d.左侧萼片；e.唇瓣；f.右侧萼片；g.药帽；h.花粉块；i.子房和柱头Fig.1 Characteristics of flowering branches and flower morphology of D.chrysanthum.A.Flowering stems；B.Flower pattern；C.Column pillar structure；D.Petals and sepals；a.Left petal；b.Middle sepal；c.Right petal；d.Left sepal；e.Labellum；f.Right sepal；g.Medicine cap；h.Pollen mass；i.Ovary and stigma

表3 束花石斛花部各器官大小（平均值±标准误差）Table 3 Organ size of the D.chrysanthum flower

2.2 束花石斛花粉活力变化

由表4 可知，花粉活力第1～3 天分别为89.9%（见图2A）、90.4%、89.7%（见图2B）。第5 天活力下降为76.4%，第7天为60.8%（见图2C），第9天花粉活力仅有23.7%，第11 天为6.5%（见图2D）。束花石斛在前3 d 内花粉活性一直处于高水平，差异不显著，从开花第5 天开始花粉活力依次下降，与前3 d 的差异达极显著水平（P＜0.01）。由此可知，束花石斛的花粉开花前4 d 活性较高，花粉水合后的萌发率也应较高。

图2 束花石斛花粉TTC染色效果A.开花第1天；B.开花第3天；C.开花第7天；D.开花第11天；a.未被染色（无活力）花粉粒；b.被染色（有活力）花粉粒Fig.2 TTC staining effect of Pollen of D.chrysanthum A.Pollen staining on the first day of flowering；B.Pollen staining on the third day of flowering；C.Pollen staining on the 7th day of flowering；D.Pollen staining on the 11th day of flowering；a.Unstained（inactive）pollen grains；b.The pollen grains are dyed（alive）

2.3 束花石斛柱头腔成熟特性

束花石斛的柱头腔的成熟度与分泌物量变化有关。束花石斛开花第2 天以后柱头开始有分沁物（见图3A），在第4天时分泌物填满柱头腔（见图3B），在第6 天时，分沁物量达到最大，凸出柱头腔，呈水晶透亮状（见图3C）。

采用联苯胺-过氧化氢法对束花石斛柱头活性检测，根据图3所示，束花石斛开花1 d的柱头有少量气泡，颜色变化甚微（见图3D）；开花3 d 的柱头有气泡产生，颜色变化有所增强（图3E）；开花5 d 的柱头有大量气泡产生，且颜色变化极其明显，过氧化氢酶活性较高（见图3F）；开花7 d以上的柱头气泡量变少，且染色变蓝较浅（见图3G），到开花第11 天时，柱头已经没有气泡，染色也未变蓝（见图3H）。过氧化氢酶的活性随着开花时间呈现由弱变强再变弱的趋势，在开花4～6 d时柱头过氧化氢酶活性最高，暗示柱头可授性较强（见表4）。

图3 束花石斛柱头腔成熟度随开花时间变化的情况A.刚开始有分泌物的柱头腔；B.被分泌物填满的柱头腔；C.分泌物凸出柱头腔；D-H分别为开花第1、3、5、7、11天经联苯胺-过氧化氢染色后的柱头腔（箭头指示处）Fig.3 Changes of stigma maturity with flowering time of D.chrysanthum A.Stigma of exudate at the beginning of drug chamber；B.Stigma that fills the chamber with secretions；C.Stigma of exudate protruding from the chamber；D-H were the stigmata stained by benzidine-hydrogen peroxide on the 1，3，5，7 and 11 d of flowering，respectively（Arrow point）

表4 束花石斛花粉活力及柱头可授性检测结果（平均值±标准误差）Table 4 Pollen viability and stigma receptivity of D.chrysanthum

2.4 自花授粉结实情况

去雄套袋未见结实，束花石斛不存在无融和生殖。试验中选取花朵开放4 d 的花粉和柱头进行人工同株异花和自花授粉，共授粉30 朵。花朵授粉后第3 天开始，花瓣逐渐向中间闭合，唇瓣逐渐皱缩，子房及萼片慢慢变黄，在7～10 d内全部萎蔫，同株异花和自花授粉结实率皆为0。

2.5 束花石斛种子形态和活力

蒴果发育成熟后，表皮呈灰绿色，圆柱状，外部有3 条凸起的棱，果实质量2.02～4.83 g，平均质量3.64 g，果实长度6.5～7.3 cm（见图4A）。

束花石斛的种子与大多数兰科植物种子一样，呈粉尘状，小而多，黄色（见图4B），整体呈狭长船形，种子无胚乳，胚位于种子中央，呈卵状。种子长0.628～0.845 mm，均值0.728 mm，变异系数为7.4%；宽0.082～0.113 mm，均值0.093 mm，变异系数为8.5%；种子长宽比为7.798（见表5）。经过显微观察，其种子成胚比高达97.35%，经过TTC染色法鉴定，新鲜的束花石斛种子生活力高达90.80%，干燥室温保存6 个月的束花石斛种子生活力达73.20%（见表5），说明自然状态下授粉结果的束花石斛种子胚发育良好，生活力强且在室温状态下可维持一定时间（见图4）。

图4 束花石斛果实、种子形态及种子活性检测结果A.成熟果实；B.新鲜的种子；C.物镜10×倍显微镜下的种子；D.TTC染色后的种子；a.无胚种子；b.有胚种子；c.未被染色（无活力）种子；d.被染色（有活力）种子Fig.4 Results of fruit and seed morphology and seed activity detection of D.chrysanthum A.Ripe fruit；B.Fresh seeds；C.Seeds under an objective microscope of 10×；D.TTC dyed seeds；a.Embryos；b.Embryos；c.Undyed（inactive）seeds；d.Dyed（active）seeds

表5 束花石斛种子形态及活力检测结果Table 5 Seed morphology and vigor test results of D.chrysanthum

3 讨论

3.1 束花石斛的生物学特征

研究发现束花石斛单花寿命最长只有15 d，平均单花寿命为12.4 d，且其在开花第1 天时花粉活力就已经非常高，开花以后的前3 d 花粉活力都接近90%，然后随开花时间延长逐渐下降。其他兰科植物中，球花石斛、鼓槌石斛单花寿命分别为7～10 d［13］、12 d［21］，属于花期较短的类型，二者的花粉成熟快，在初开时活力就达到最大。而兜兰［15，22］、国兰［19］、大花蕙兰（Cymbidium hybridum）［19］等花期较长的种，花粉的活力通常在开花中期才能达到最大，因此推测兰科植物花粉发育规律与开花期的长短有关。本试验中采用TTC 检测束花石斛的花粉活力与邓茜玫［23］萌发法测得的56.2%差距较大，推测是由离体萌发条件所致。兰科植物属于湿柱头，其柱头的黏液基质中含有大量的分泌细胞，可能与识别过程的信号传导有关［24］。柱头发育成熟关系到花粉的识别和水合过程，研究表明，成熟柱头表面的过氧化物酶（SOD、POD、H2O2等）和酯酶的活性达到最高［25-26］。依据柱头分泌规律可判断其发育状况和可授性，如蝴蝶兰‘天香公主’开花当天可看见柱头分泌黏液，随着开花天数的增加，柱头黏性减弱，透明度减弱［15］。束花石斛开花后第6天时黏液分泌量最多，呈水晶透亮状，与蝴蝶兰‘天香公主’的分泌规律不同。目前兰科植物中已经报道了柱头黏液分泌特性的不多，本研究以黏液分泌特性与联苯胺染色相结合，从表型上确定束花石斛柱头可授性，对束花石斛人工授粉时机的选择提供直观的指导。

本次试验用的束花石斛由其他地方引入载种，昆明地区并非束花石斛原产地。云南麻栗坡地区栽种的长距石斛（D. longicornu）自交不结实而异交结实，但在深圳种植则自交和异交均不结实。在麻栗坡地区，长距石斛自交不亲和是因为花粉管在花柱上半部分生长停止，而深圳地区的是因为花粉管被膜状体包被阻碍花粉管萌发生长，膜状物可能通过阻碍花粉管的生长，从而对不适应的环境产生拮抗［7，27］。Niu 等［7］连续2 年进行束花石斛自花授粉，2015 年自交结实率为0，2016年为3%，株内自花和异花授粉的结实率为零，而两年异花授粉的结实率均为100%。生境的改变可能也会影响兰科植物授粉后的结实率，束花石斛自交试验中未结实可能由样本生境改变导致。课题组在进行束花石斛人工授粉时因为没有足够的开花样本支持，加之各种源地植株花期不遇，未进行异株之间的授粉。

3.2 束花石斛的繁育系统

兰科植物雌雄蕊发育同步性影响其交配系统，对物种的雌雄蕊发育状况进行观测，有利于其繁育系统的科学判断，对人工杂交授粉期确定也尤为重要。石斛属的繁育系统多样，有异交亲和、异交和自交都亲和、自交亲和。异交物种具有雌雄蕊空间异构、雌雄蕊异熟、花粉自交不亲和等特性［28］。球花石斛在花初开时，花粉活力就达到最大，而柱头发育则要晚于花粉成熟期，研究表明，人工异花授粉时球花石斛结实，同花授粉不能结实［13，29］。在报道的自交结实的石斛种类中，重唇石斛（D.hercoglossum）花开第5～12天花粉萌发较高，柱头在开花6～8 d 后成熟，属于雌雄同熟，但自交结实率极低［30］。井冈山地区产的铁皮石斛（D.officinale），在开花第3天的花粉活力可达到90%，柱头可授性同时达到最高，人工自交结实仅为22%［31］。其他已研究的兰科植物中，雌雄同熟的长瓣兜兰（Paphiopedilum dianthum），人工自花授粉、同株异花授粉和异株授粉皆可结实［22］。本试验结果表明，束花石斛单花期较短，群体花期较整齐，柱头发育稍晚于花粉，虽然在柱头发育成熟的阶段，花粉还能保持较高活性，但人工株内自花和异花授粉却表现不亲和，李乐兴［32］认为其配子体的不亲和可能与DC-ADK2基因表达有关，牛善策［27］研究推测是花柱特异表达基因TRINITYDN31133_c0_g1_i2（编码锌指蛋白）与花柱特异表达基因Dch2-RALF的互作结果，同时还发现部分植物激素存在与自交不亲和反应紧密相关的浓度变化。

交配方式对石斛兰结实率会有影响。目前已报道的自交和异交皆亲和的石斛种有：金钗石斛（D.nobile）、大苞鞘石斛（D.wardianum）、肿节石斛（D. pendulum）、玫瑰石斛、王亮石斛（D. wangliangii）、长苏石斛（D. brymerianum）；球花石斛、兜唇石斛（D. aphyllum）、长距石斛的交配系统为异交［9，21，33］。王 亮 石 斛 的 自 交 结 实 率 高 于 异 交 结实［11］。Pang 等［34］发现夹江石斛（D.jiajiangense）自交亦亲和，但人工授粉的种子生活力低于自然结实的种子。目前，有学者从基因选择和资源投入不同的角度对植物交配系统形成的机制进行初步阐述。有关自交亲和的生态机制，Busch 等［35］从基因流层面总结分析，自交可减少缺乏有效传粉者造成的生殖失败和能量损耗，增加了物种传播优势和维持种群数量。Bartareau［36］以自交不亲和的D.monophyllum为例，通过3 年的试验数据研究表明，避免自交亲和是在权衡吸引传粉者的投入和结实成本投资条件下，形成适应性进化。束花石斛在野生状态下能成功结实，且种子成胚率和活力都较高，说明其在原生环境下不缺乏传粉者，具有完善的异交传粉机制。

4 结论

束花石斛的花粉在花初开时就已经达到最大活力，而柱头发育要滞后于花粉的发育，属于雌蕊后熟的类型，不存在无融和生殖。人工自花授粉不育，但自然状况下能正常结实，种子发育良好，胚活力较高。作为育种亲本材料，花粉采集的时间为开花后1～3 d，柱头在开花后第5天左右，具有较高的授粉亲和力。本研究揭示了束花石斛的开花生物学特性和雌雄蕊异熟特点，其交配系统应为自交不亲和，为其野生种质资源的保育和人工精准授粉提供科学依据。