HPLC法测定滇产白花蛇舌草及伪品中去乙酰车叶草酸甲酯的研究

赫伟 周成蕾

基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目（2019J0259）。

作者简介：

赫伟（1988—），女，满族，硕士，讲师，研究方向为中药质量标准研究。E-mail：lnhewei@126.com

通信作者：

周成蕾（1986—），男，汉族，硕士，主管中药师，研究方向为中药质量标准研究。E-mail：406731676@qq.com

【摘  要】

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）测定滇产白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量，提高白花蛇舌草定性定量的专属性鉴别。方法：采用Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱；流动相∶[KG-*3/5]乙腈-水（3.5∶[KG-*3/5]96.5）；检测波长：238 nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min;进样量：10μL。结果：白花蛇舌草检出去乙酰车叶草酸甲酯，其伪品未检出，乙酰车叶草酸甲酯在3.7683～241.1684μg/mL（r=0.99985）范围内线性关系良好；平均回收率为94.40%，RSD为2.3%。结论：建立的方法，可用于白花蛇舌草与伪品的鉴别，为评价该药材质量具有借鉴意义。

【关键词】

滇产；白花蛇舌草；去乙酰车叶草酸甲酯；含量测定

【中图分类号】R284.1    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）24-0033-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324007

HPLC Determination of the Content of Deacetylated Methyloxalate in Hedyotis diffusa and

tis Counterfeits Produced in Yunnan

HE Wei1  ZHOU Chenglei2*

1.Dehong Vocational College， Dehong 678400， China;2.Dehong Institute for Food and Drug Control， Dehong 678400， China

Abstract：

Objective To determinethe content of deacetylated methyloxalate in Hedyotis diffusa produced in yunnan by HPLC-DAD，to improve qualitative method of Hedyotis diffusa.Methods The Zorbax Eclipse XDB-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）was used for determination ofdeacetylated methyloxalate. Gradient elution with acetonitrile and water was performed（the proportion is  3.5∶[KG-*3/5]96.5）.The deacetylated methyloxalate was detected at a wavelength of 238 nm;the system operated at 25℃;flow rate was 1mL/min and the injection volume was 10μL.Results The deacetylated methyloxalate was detected in Hedyotis diffusa，but the counterfeit was not detected.The deacetylated methyloxalateshowed good linearity in the ranges of 3.7683-241.1684μg/mL（r=0.99985），and the average recoveries were 94.40%，RSD=2.3%.Conclusion The HPLC method established is a rapid and accuracy，and can be used to distinguish Hedyotis diffusa from counterfeit，andis helpful to tis quality control.

Keywords：

Produced in Yunnan;Hedyotis Diffusa Willd.;Deacetylated Methyloxalate;Assay

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.，为云南省各地方少数民族的常用药，始载于1971年5月出版的《云南中草药》［1］，后在《德宏民族药名录》［2］《拉祜族民间特色药用植物》［3］和《哈尼族药用植物》［4］也有记载，主要有清热解毒、活血止痛和利尿消肿的功能［5］。在云南地区常见伪品为同科同属植物纤花耳草Hedyotis tenelliflora BI.和伞房花耳草Hedyotis corymbosa L.，常作为白花蛇舌草药材混用。

研究［6］表明白花蛇舌草中主要含有萜类、黄酮类、蒽醌类、苯丙素和香豆素类、挥发油类、含酸化合物、多糖类及其他类。现代药理研究［7］表明白花蛇舌草具有抗炎、抗氧化、抗恶性肿瘤等作用，在临床广泛运用于恶性肿瘤的中药治疗。目前白花蛇舌草药材收载于2005年版《中国药典》附录里［8］，全国有25个省级中药材、民族药材质量标准，23个省级中药饮片炮制（切制）规范收载白花蛇舌草药材，云南省暂未收载该药。本文采集到云南省产地的白花蛇舌草及其伪品纤花耳草、伞房花耳草，共14批样品（样品信息见表1），选定对人体肝癌、结肠癌细胞有较好抑制作用的去乙酰车叶草酸甲酯［9-10］作为含量测定指标成分，为白花蛇舌草药材的质量控制标准提供了研究数据。

1  仪器与材料

1.1  仪器  Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；101A-2电热干燥箱（宁波自动化仪表厂）；SB-5200D超声波清洗机（功率：360 W;频率：40 KHz；宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BS224S型电子分析天平（万分之一，德国Sartorius公司）；MS205DU型电子分析天平（十万分之一，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2  材料  去乙酰车叶草酸甲酯对照品（批号：C0005304，含量92.9%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，ADS-8型大孔吸附树脂（郑州新材料科技有限公司）；白花蛇舌草、纤花耳草药材和伞房花耳草样品（信息表见表1）均由经中科院昆明植物所杨文光副研究员鉴定。

2  方法与结果

2.1  色谱条件  Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相乙腈-水（3.5∶[KG-*3/5]96.5），流速为1.0mL/min，检测波长为238 nm，柱温为25℃。

2.2  对照品溶液的制备  精密称取去乙酰车叶草酸甲酯对照品0.01298 g置25mL容量中，加流动相溶解并稀释至刻度配，作为对照品贮备液。

2.3  供试品溶液的制备  参照2020版《中国药典》一部红花颗粒含量测定供试品提取方法［11］，取白花蛇舌草及伪品样品（过四号筛）约3 g，精密称定，置250mL三角烧瓶中，精密加水50mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用水补足失重，摇匀，离心，精密量取滤液10mL，通过ADS-8型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为15 cm），用水100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80%甲醇200mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水适量，超声使溶解，并转移至10mL量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，将上述两种溶液分别进样10μL，测定。如图1所示。

2.4  空白样品液制备  按缺供试品的阴性样品，按“2.3供试品溶液的制备”的方法操作，制成空白样品。

2.5  样品水分测定  参照2020版《中国药典》四部通则0832 第二法［12］进行测定。结果测定值见表2。

2.6  标准曲线的制备及线性关系考察  精密吸取去乙酰车叶草酸甲酯对照品贮备液，加流动相逐级稀释，分别得到质量浓度为3.7683 μg/mL、7.5365 μg/mL、15.0730 μg/mL、30.1461 μg/mL、60.2921 μg/mL、120.5842 μg/mL、241.1684μg/mL的对照品溶液，进样10μL。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标计算回归方程为Y=13.90740X+3.89093  （r=0.99985）。结果表明，去乙酰车叶草酸甲酯在3.7683～241.1684μg/mL线性范围内关系良好。按照条件进行测定并分别计算检出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10），结果测定的检测限为0.3789μg/mL，定量限为1.2630μg/mL。

2.7  精密度试验  精密吸取对照品30.1461μg/mL10μL，连续进样6次，测定，测得去乙酰车叶草酸甲酯峰面积RSD为0.21%，结果表明，仪器精密度良好。

2.8  重复性试验  精密称取同一样品（编号S5）6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样20μL进行测定，计算去乙酰车叶草酸甲酯的含量，结果RSD为1.08%，表明该方法重复性良好。

2.9  稳定性试验  精密吸取供试品（编号S5）溶液20μL进行测定，分别于制备后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h进样，测定，去乙酰车叶草酸甲酯峰面积RSD为1.58%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.10  加样回收率试验  精密称取同一样品（编号S5）9 份，每份约3 g，精密加入，分别精密加入适量的对照品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别进样20μL进行测定，计算回收率，结果平均回收率为，计算回收率94.40%，RSD为2.3%，表明該方法加样回收率试验良好。结果见表3。

2.11  样品测定结果  精密称取各地样品适量，同法制备供试品溶液，进样20μL，注入液相色谱仪，进行测定，外标法计算。结果见表3。

3  讨论

3.1  检测波长的选择  经DAD全波长扫描，去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液在238 nm处有最大吸收波长，因此确定检测波长为238 nm。

3.2  色谱条件的选取  在前期研究中，本课题组对不同流动相乙腈-水-冰乙酸（4∶[KG-*3/5]96∶[KG-*3/5]0.2）溶液、乙腈-0.03磷酸溶液（75∶[KG-*3/5]25，V/V）、乙腈-水溶液（80∶[KG-*3/5]20，V/V）、乙腈-水溶液（75∶[KG-*3/5]25，V/V），不同柱温（20℃、25℃、30℃、35℃）、不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min、1.5mL/min）、不同进样量（5μL、10μL、15μL、20μL）、不同色谱柱（Titank C18、Zorbax Eclipse XDB-C18、Shim-pack VP-ODSC18）等色谱条件进行了考察，最终确定了“2.1”项下色谱条件。

3.3  不同大孔树脂的考察  对D-101、ADS-8及Diaion HP20大孔树脂进行了考察，发现通过ADS-8大孔吸附树脂柱填料洗脱液杂质较少，吸附影响较小，故选择ADS-8大孔吸附树脂柱填料。不同洗脱剂比例的考察分别对50%、60%、70%、80%甲醇做洗脱剂进行考察，结果显示所收集样品用80%甲醇做为洗脱剂含量，所以选择80%即可。

通过实验，白花蛇舌草检出去乙酰车叶草酸甲酯，纤花耳草及伞房花耳草均未检出。目前，现行的白花蛇舌草药材质量标准是以熊果酸和齐墩果酸作为其含量测定成分，实验组在开展探索性实验，发现纤花耳草及伞房花耳草均含有较高的熊果酸和齐墩果酸成分，表明专属性不强。因此可考虑以去乙酰车叶草酸甲酯作为白花蛇舌质量标准含量测定指标成分，以提高鉴别和含量测定的专属性。

参考文献

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［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2020：970-971.

［12］国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2020：114-115.

（收稿日期：2023-03-29  编辑：陶希睿）