HPLC法与GC法测定清眩片中藁本内酯含量的比较

彭建彪 龙凯 许春梅 赵远翠

基金項目：

作者简介：

彭建彪（1982—），男，彝族，本科，主管药师，研究方向为药物分析。E-mail：745058323@qq.com

通信作者：

【摘  要】

目的：比较HPLC法与GC法测定清眩片中藁本内酯含量的优劣，为清眩片中藁本内酯含量测定提供参考。方法：以藁本内酯为对照品，分别采用HPLC法与GC法对方中川芎进行含量测定。HPLC法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶柱（依利特 SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（70∶[KG-*3/5]30）；检测波长：326nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。GC法色谱条件：采用（50%）二苯基-（50%）二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（HP-50+ 0.50μm，0.32 mm，30 m）；程序升温，起始温度为110℃，维持2 min，以7℃/min的速率升温至180℃，再以10℃/min的速率升温至220℃，维持5 min；进样口温度250℃；检测器（FID）温度260℃；以氮气为载气，流速为5.0mL/min。结果：HPLC法藁本内酯在0.0776～1.5510 μg范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.9999，平均回收率为99.79%（RSD=0.29%，N=6）。GC法藁本内酯在0.0078～0.1551 μg范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.9992，平均回收率为105.75%（RSD=1.93%，N=6）。结论：两种方法均可以准确测定清眩片中藁本内酯的含量，HPLC法准确度与精密度都优于GC法，可以作为清眩片中藁本内酯含量测定的首选方法。GC法具有灵敏度高、分析成本低等优势可以作为清眩片中藁本内酯含量测定的备选方法。

【关键词】  清眩片；藁本内酯；含量测定；HPLC；GC

【中图分类号】R284.1    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）24-0041-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324009

Determination of Ligustilide in Qingxuan Tablet by HPLC and GC

PENG Jianbiao  LONG Kai  XU Chunmei  ZHAO Yuancui

HongHe Prefeture Institute for Food and Drug Control， Mengzi 661199， China

Abstract：

Objective To compare the content of ligustilide in Qingxuan tablets by HPLC and GC， and to provide reference for the content determination of ligustilide in Qingxuan tablets.Methods The content of ligusticum Chuanxiong was determined by HPLC and GC using ligustilide as reference. HPLC chromatographic conditions： silica gel column （SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm， 5μm） was bonded with octadecyl silane. Mobile phase： methanol-water （70∶[KG-*3/5]30）; Detection wavelength： 326 nm; Flow rate ：1.0mL/min， Column temperature： 30℃. GC chromatographic conditions： （50%） diphenyl - （50%） dimethyl polysiloxane as fixed liquid capillary column （HP-50+ 0.50μm， 0.32 mm， 30 m）; The initial temperature was 110℃ for 2 minutes， and the temperature was heated to 180℃ at the rate of 7℃/min， and then heated to 220℃ at the rate of 10℃/min for 5 minutes. Inlet temperature 250℃; Temperature of detector （FID） ： 260℃; Nitrogen was used as carrier gas at a flow rate of 5.0mL/min. Results The ligustilide was linear in the range of 0.0776-1.5510 μg by HPLC. The correlation coefficient R2 was 0.9999. The average recovery was 99.79%（RSD=0.29%，N=6）. The ligustilide showed a good linear relationship in the range of 0.0078-0.1551 μg with the correlation coefficient R2=0.9992. The average recovery was 105.75%（RSD=1.93%，N=6）.Conclusions  Both methods can accurately determine the content of ligustilide in Qingxuan tablets. HPLC method is superior to GC method in accuracy and precision， and can be used as the first choice for the determination of ligustilide in Qingxuan tablets. GC method has the advantages of high sensitivity and low analysis cost and can be used as an alternative method to determine the content of ligustilide in Qingxuan tablets.

Keywords：

Qingxuan Tablets; Ligustilide; Content Determination;HPLC;GC

清眩片为中药成方制剂，执行标准为2020年版《中国药典》一部［1］，由川芎、白芷、薄荷、荆芥穗、石膏五味药制备而成。具有散风解热的功效，用于风热头晕目眩、偏正头痛、鼻塞牙痛。制剂处方中君药川芎活血行气、祛风止痛，用于胸痹心痛、胸胁刺痛、跌扑肿痛、月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、头痛、风湿痹痛［2］。研究［3］表明其主要活性成分藁本内酯具有抗炎、镇痛、抗氧化、神经保护等多种药理活性。藁本内酯在川芎药材中的含量也相对较高，而现行质量标准未测定藁本内酯不够全面。为了保证成品转移率；更好地控制清眩片的质量，保证临床用药的安全有效，将其作为清眩片质量控制的主要指标之一更为合理。藁本内酯为挥发油，具有挥发性，沸点168～169℃（800 Pa），采用GC法和采用HPLC法测定藁本内酯含量均有文献报道［4-5］，故采用HPLC法与GC法对清眩片中的藁本内酯进行定量研究比较。

1  仪器与试药

1.1  仪器  ThermoUltimate3000高效液相色谱仪；ThermoTRACE1310气相色谱仪；Sartorius BP211D电子天平；北京汇龙HLPT-300H型氢气发生器。

1.2  试药  藁本内酯对照品（批号：111737-201910，中国食品药品检定研究院）；清眩片（批号：210801，云南云河药业股份有限公司）；所用试剂甲醇（色谱纯，霍尼韦尔贸易上海有限公司）；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；水为超纯水。

2  方法与结果

2.1  高效液相色谱法测定藁本内酯的含量

2.1.1  色谱条件  色谱柱：依利特 SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm，5μm；流动相：甲醇-水（70∶[KG-*3/5]30）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：326 nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于5000。

2.1.2  对照品溶液的制备  取藁本内酯对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含45 μg的溶液，即得。

2.1.3  供试品溶液的制备  取本品20片，精密称定，研细，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率53 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4  专属性试验  取按清眩片处方剂量及工艺要求制备缺川芎的阴性样品0.6 g，按“2.1.3”项下方法制成阴性样品溶液，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果在记录的色谱图中，供试品溶液呈现与藁本内酯对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰，而阴性样品溶液未呈现与藁本内酯对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰，可见其他原辅料对藁本内酯峰无干扰。如图1～3所示。

2.1.5  稳定性试验  取同一份供试品溶液，按上述色谱条件分别在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、20 h时进样测定，测得藁本内酯峰面积积分值分别为21.2182、21.2983、21.4357、21.4739、21.5216、21.7590、21.2611， RSD 为0.56%，表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.1.6  不同检测波长  取清眩片（ 批号210801）供试品溶液，在检测波长为324 nm、326 nm、328 nm下测定其含量，分别为3.5976 mg/g、3.5879 mg/g、3.5871 mg/g，RSD为0.16%，结果表明，在检测波长（326±2） nm范围变化，对藁本内酯含量测定基本没有影响，结果稳定。

2.1.7  线性关系考察  取藁本内酯对照品適量，精密称定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含藁本内酯0.1551 mg的溶液，分别精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值Y对进样量X（μg）进行回归处理。结果藁本内酯回归方程为Y=0.4832X-0.0147（R2=0.9999），表明藁本内酯进样量与峰面积在0.0776～1.5510 μg范围内具有良好的线性关系。

2.1.8  重复性试验  取供试品，按“2.1.3”项下方法，分别制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，藁本内酯的平均含量为3.7027 mg/g，RSD为0.46%，结果表明此方法重复性良好。

2.1.9  加样回收率试验  取供试品（批号210801，已知藁本内酯含量为3.7027 mg/g）20片，精密称定，研细，称取6份，每份约0.3 g，精密称定，按1∶[KG-*3/5]1比例加入藁本内酯对照品，即精密加入藁本内酯对照品溶液（藁本内酯浓度0.0217 mg/mL）50 mL。按“2.1.3”项下方法，分别制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

2.2  气相色谱法测定藁本内酯的含量

2.2.1  色谱条件  色谱柱：以（50%）二苯基-（50%）二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（HP-50+ 0.50μm，0.32 mm，30 m）；程序升温，起始温度为110℃，维持2 min，以7℃/min的速率升温至180℃，再以10℃/min的速率升温至220℃，维持5 min；进样口温度250℃；检测器（FID）；温度260℃；以氮气为载气，流速为5.0mL/min；直接进样，进样量为1 μL。

2.2.2  对照品溶液的制备  取藁本内酯对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.15 mg的溶液，即得。

2.2.3  供试品溶液的制备  取本品20片，精密称定，研细，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率53 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4  专属性试验  取按清眩片处方剂量及工艺要求制备缺川芎的阴性样品0.6 g，按“2.2.3”项下方法制成阴性样品溶液，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果在记录的色谱图中，供试品溶液呈现与藁本内酯对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰，而阴性样品溶液未呈现与藁本内酯对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰，可见其他原辅料对藁本内酯峰无干扰。如图4～6所示。

2.2.5  线性关系考察  取藁本内酯对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含藁本内酯0.1551 mg的溶液，分别精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值Y对进样量X（μg）进行回归处理。结果藁本内酯回归方程为Y=0.0619X-0.3053（R2=0.9992），表明藁本内酯进样量与峰面积在0.0078～0.1551 μg范围内具有良好的线性关系。

2.2.6  重复性试验  取供试品，按“2.2.3”项下方法，分别制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定并计算藁本内酯的含量，结果藁本内酯含量的RSD为1.04%，表明此方法重复性良好。

2.2.7  加样回收率试验  取供试品20片，精密称定，研细，称取6份，每份约0.6 g，精密称定，按0.5∶[KG-*3/5]1比例加入藁本内酯对照品，即精密加入藁本内酯对照品溶液（藁本内酯浓度0.0217 mg/mL）50 mL。按“2.2.3”项下方法，分别制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。

2.3  高效液相色谱法与气相色谱法测定结果比较  对收集到的5家生产企业各批次清眩片，分别用高效液相色谱法与气相色谱法测定藁本内酯的含量，并对测定结果进行Bland-Altman散点图评价分析。结果见表3。

两种方法含量测定数据差值的平均值D=0.012 mg/片，差值的标准差S=0.058052，则95%一致性界限为0.012±1.96×0.058052，即（-0.1018 mg/片，0.1258 mg/片）。可以看出差值所有的点均在95%一致性界限以内，因此可以认为两种测定方法的结果具有较好的一致性。

3  讨论

3.1  提取方法的确定  根据藁本内酯的理化特性查阅资料［5］后对清眩片中藁本内酯提取方法提取时间考察发现，乙醇、甲醇、50%甲醇超声提取效率相差不大，其中甲醇提取效率略高；超声30 min与超声30 min以上时间的提取效果无显著差别。故将提取方法确定为甲醇超声提取30 min。

3.2  高效液相色谱条件的选择  取藁本内酯对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含8 μg的溶液，在190～400 nm 波长处进行紫外扫描，结果在326 nm波长处有最大吸收，故选择326 nm作为藁本内酯HPLC含量测定波长；在试验中通过不断的调整以甲醇－水（70∶[KG-*3/5]30）洗脱时峰形良好，分离度好，所以以甲醇－水（70∶[KG-*3/5]30）作为流动相；试验中还分别将柱温调至25℃、30℃、35℃，发现3种柱温除对保留时间有一定影响外，对峰形和分离度影响甚小，结合实际环境条件将柱温确定为30℃。

3.3  高效液相色谱法含量限度拟定  此次试验对收集到5个厂家生产的清眩片进行了藁本内酯含量测定，不同厂家所生产清眩片中藁本内酯的含量相差较大。取川芎药材70%乙醇回流提取后测定藁本内酯的含量为7.08 mg/g，与文献报道［6］川芎70%乙醇回流提取两次（与清眩片制法中川芎的处理方法一致。）藁本内酯的含量为6.99 mg/g相互吻合，如果按照6.99 mg/g计算，各厂家清眩片有效成分藁本内酯转移率从11%到75%不等。没有统一的标准来控制藁本内酯含量，各企業的生产工艺也有所不同，致使清眩片中藁本内酯的含量相差较大，导致相同的剂量临床效果相差较大。为此制定统一的标准，能更好的控制清眩片的质量。结合实际生产过程中的损失，以及样品数量有限，暂且将含量限度拟定为每片含川芎以藁本内酯计，不得少于0.5 mg。5家企业生产的7个批次清眩片中藁本内酯含量分布在0.30～1.99 mg之间，平均值为0.95 mg。其中1家生产企业生产的1批次样品含量低于拟定限度。

从试验数据可看出HPLC法与GC法专属性、精密度、线性以及准确度考察均符合要求［7］，两种方法具有较好的一致性，均可以准确测定清眩片中藁本内酯的含量，HPLC法准确度与精密度都优于GC法，可以作为清眩片中藁本内酯含量测定的首选方法。GC法具有灵敏度高、分析成本低等优势可以作为清眩片中藁本内酯含量测定的备选方法。

参考文献

［1］

国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：1686-1687.

［2］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：42-43.

［3］何树苗，陈元堃，曾奥，等.藁本内酯药理作用及机制研究进展［J］.广东药科大学学报，2021，37（2）：152-156.

［4］南海军，蔡绮，谭玉彬，等.气相色谱法测当归挥发油中藁本内酯的含量［J］.海峡药学，2014，26（9）：42-44 .

［5］李平， 李榆梅.高效液相 -紫外检测法测定当归中藁本内酯含量［J］.山西医科大学学报，2010，41（1）：30-32.

［6］胡杰，冯丽莉，刘延，等.当归、川芎中藁本内酯含量测定及醇提工艺研究［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（2）：145-148.

［7］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：480-483.

（收稿日期：2023-03-31  编辑：陶希睿）