鼠尾草酸通过抑制阿尔茨海默病小鼠脑内炎症反应减少β淀粉样蛋白沉积的机制

贺晓文，边竞

（中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳 110001）

阿尔茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 又称为老人失智症、老年痴呆症、脑退化症，是最常见的神经退行性疾病。目前，AD已成为世界上最常见的痴呆类型之一。且随着世界老龄化人口增加，AD发病率逐年上升。由于AD暂无有效的防治手段，给患者家庭和社会均带来沉重的经济负担。因此，找到AD的发病原因并寻找有效的预防手段尤其重要［1］。

AD的病因不明，其主要病理特征为神经元内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结和胞外剪切生成的以β淀粉样蛋白 （amyloid β-protein，Aβ）沉积形成的老年斑［2-3］。大量研究结果显示，炎症反应是AD发病的主要原因之一，脑内沉积的Aβ可通过与神经胶质细胞上的受体结合，激活星形胶质细胞和小胶质细胞，释放大量炎性细胞因子和趋化因子，炎性细胞因子包括NOD样受体蛋白3 （NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 （interleukin，IL） -6和IL-1β等。这些炎性细胞因子可进一步促进淀粉样前体蛋白 （amyloid precursor protein，APP） 向淀粉样蛋白剪切途径进行，促使Aβ生成增多，最终形成恶性循环，加快AD的进程［4-5］。

近年来，针对AD的治疗药物越来越多，主要包括胆碱酯酶抑制剂 （多奈哌齐等）、谷氨酸受体拮抗剂 （美金刚） 以及甘露特纳，但是这些药物都无法达到预期的治疗效果，且存在潜在的不良反应［6-7］。鼠尾草酸 （carnosic acid，CA） 主要存在于鼠尾草和迷迭香等植物中，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用［8-10］。研究［11］发现，CA能够抑制多种皮肤炎症，且对人体无毒。此外，CA能够通过降低TNF-α的表达，抑制细胞内炎症反应［12］。因此，CA可能具有广泛的抗炎作用。然而，CA能否通过降低神经炎症反应减少Aβ生成和沉积数量，进而延缓AD的病理进程，尚未见报道。因此，本研究通过给予AD小鼠CA，研究CA对AD的影响，并探索其是否可以通过核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 抑制小鼠大脑皮层免疫炎症反应，从而改善AD小鼠的认知功能障碍，最终延缓AD的发病进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂盒：CA，购自中国MedChemExpress公司；NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB、p-NF-κB、Aβ抗体、β-actin、二抗、Alexa Fluor 555标记的荧光二抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒，购自美国Abcam公司。

1.1.2 仪器：Morris水迷宫，购自中国安徽正华生物仪器设备有限公司；激光共聚焦显微镜，购自日本尼康公司；酶标仪，购自美国伯腾仪器有限公司。

1.1.3 实验动物和分组：5月龄APP/PS1转基因小鼠（AD模型） 18只，购自北京华阜康生物科技有限公司，体质量25～28 g。将18只小鼠分为对照组和CA组，每组9只。CA组：腹腔注射CA （20 mg·kg-1·d-1），连续注射2个月；对照组：腹腔注射相同体积的生理盐水，连续注射2个月。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫实验：实验分为3个时期。训练期为2 d，3次/d，每次间隔1 h；可视平台期为5 d，3次/d，每次间隔1 h；第8天为隐蔽平台期，移走平台，记录小鼠穿越原来平台位置的次数。每只小鼠进行3次实验。

1.2.2 组织取材：10%水合氯醛 （10 g/3 μL） 麻醉小鼠，待小鼠进入深度麻醉状态 （手术镊子夹小鼠四肢未见反应即可），立刻将小鼠固定于解剖台上。剖开胸腔并剪去横膈膜，暴露心脏，在左心室左下角开一个小口，将灌流针由左心室插入主动脉，并用止血钳固定住针头，剪开右心耳，立即用0.9% NaCl灌流，灌流4～6 min，至肝脏边缘无血丝为止。迅速断头，剖取小鼠大脑，于冰上一分为二。一部分放入4%多聚甲醛中固定保存，用于免疫组织化学中的形态学检测；另一部分放入-80 ℃冰箱保存，用于蛋白提取、Western blotting等分子生物学检测。

1.2.3 Western blotting：前额皮层组织称重，加入RIPA裂解液 （内含蛋白酶抑制和磷酸酶抑制剂） 后进行超声破碎。破碎后，放置冰上裂解3～4 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，进行蛋白质定量后深度低温保存，用于Western blotting检测。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶，转膜完成后，PVDF膜用2%脱脂牛奶封闭，抗体4 ℃孵育过夜。第2天二抗室温孵育45 min，洗膜，ECL发光并显影。

1.2.4 免疫荧光染色：切片水化后，用羊血清封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。荧光二抗室温孵育2 h，PBS漂洗后，防荧光淬灭剂封片，显微镜下采集图像。

1.2.5 ELISA检测：按照试剂盒操作，测定小鼠皮层中炎性细胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 统计学分析

采用Prism7.0软件进行统计学分析。数据用±s表示，组间比较采用t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CA对AD小鼠学习记忆能力的调控

水迷宫实验结果显示，对照组小鼠和CA组小鼠寻找可视平台的时间无统计学差异 （P＞ 0.05），说明2组小鼠的运动能力和视力无显著差异。隐蔽平台实验结果显示，与对照组相比，CA组小鼠逃避潜伏期明显缩短 （P＜ 0.05），说明CA可提高小鼠的记忆能力，且可明显缓解AD小鼠的空间记忆损伤 （P＜0.05）。见图1。

图1 CA对AD小鼠空间学习记忆能力的影响Fig.1 Effects of carnosic acid on spatial learning and memory abilities of AD mice

2.2 CA对AD小鼠大脑皮层中Aβ沉积数量和胶质细胞活化的影响

免疫荧光双标记染色结果显示，对照组小鼠的大脑皮层出现大量Aβ老年斑沉积，并且其周围的神经胶质细胞明显增多。与对照组相比，CA组小鼠大脑皮层中Aβ老年斑数量明显减少，星形胶质细胞和小胶质细胞明显减少。说明CA可能通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少Aβ的生成，进而延缓AD的发病进程。见图2、3。

图2 皮层中Aβ老年斑沉积和星形胶质细胞的共定位情况Fig.2 The co-localization of Aβ senile plaques and astrocytes in the cortical area

图3 皮层中Aβ老年斑沉积和小胶质细胞的共定位情况Fig.3 The co-localization of Aβ senile plaques and microglia in the cortical area

2.3 CA对AD小鼠大脑皮层中炎性细胞因子的影响

ELISA结果 （图4） 显示，与对照组相比，CA组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平明显降低 （P＜0.05）。Western blotting结果 （图5） 进一步证实，与对照组相比，CA组小鼠NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平明显降低 （P＜ 0.05），CA抑制NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。说明CA可明显抑制AD小鼠脑内炎症反应。

图4 ELISA检测CA对AD小鼠脑内炎性细胞因子的影响Fig.4 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by ELISA

图5 Western blotting检测CA对AD小鼠脑内炎性细胞因子的影响Fig.5 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by Western blotting

2.4 CA通过NF-κB信号通路抑制AD小鼠脑内炎性细胞因子表达

与对照组相比，CA组p-NF-κB的表达明显降低（P＜ 0.05）。说明CA可能通过NF-κB信号通路抑制AD小鼠免疫炎症反应，进而改善小鼠的学习记忆能力。见图6。

图6 CA对AD小鼠脑内NF-κB信号通路的影响Fig.6 Effects of carnosic acid on NF-κB signaling in the brains of AD mice

3 讨论

Aβ形成过程中伴随着神经胶质细胞活化，产生大量的炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等。而小胶质细胞持续激活削弱了其结合和吞噬Aβ的能力，并降低Aβ的降解，进一步增加Aβ的沉积数量，加快AD的发病进程。

NF-κB在神经系统中神经元损伤的细胞反应中发挥重要作用。NF-κB通过调节细胞因子和免疫应答基因的转录来调节免疫。在刺激作用下，NF-κB从细胞质转位到细胞核，诱导靶基因转录［13］。重要的是，AD患者死后脑退化细胞中可见明显的NF-κB活化。在胶质增生过程中，Aβ神经毒性依赖于NF-κB［14］。相反，阻断NF-κB可减轻IL-1β诱导的变性［15］。NF-κB抑制被认为是减少神经炎症损伤，从而延缓AD发病进程的潜在靶点。

CA是一种天然化合物，是从迷迭香中分离得到的一种酚类二萜，因其药理作用而受到越来越多的关注。研究［9］证实，CA可逆转Aβ引起的海马神经元损伤，进而起到保护神经元的作用。此外，CA可通过抑制神经胶质细胞产生的炎性细胞因子，改善AD小鼠的认知功能障碍。

本研究检测了炎性细胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，结果发现，与对照组相比，CA组NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达明显降低，p-NF-κB表达明显降低，提示CA可能通过NF-κB信号通路抑制炎性细胞因子的表达，进而抑制AD小鼠脑内的免疫炎症反应，最终延缓AD的病理进程。免疫荧光双标记染色结果进一步揭示，CA可抑制AD小鼠脑内Aβ的生成以及减少Aβ的沉积数量，抑制神经胶质细胞的活化。行为学实验证实，CA改善AD小鼠的认知功能障碍，为今后在临床上CA防治AD提供实验基础和理论依据。

综上所述，本研究结果表明，CA可通过抑制APP/PS1转基因小鼠脑内免疫炎症反应，进而减少AD小鼠脑内的Aβ沉积数量，最终改善AD的认知功能障碍。本研究为CA今后用于防治AD提供了有力的理论依据。