缺氧肝细胞癌细胞来源外泌体miR-432-5p通过SOCS3/STAT3促进M2型巨噬细胞极化

蒋磊，李玉强，李男，吴彬，赵硕

（锦州医科大学 1. 附属第一医院普外科，辽宁 锦州 121001； 2. 附属第一医院临床生物样本中心，辽宁 锦州 121001； 3. 附属第一医院重症医学科，辽宁 锦州 121001； 4. 附属第三医院护理部，辽宁 锦州 121000）

肝细胞癌 （以下简称肝癌） 是消化系统常见的恶性肿瘤，其发生、发展与肿瘤微环境密不可分［1］，而缺氧是一个重要的微环境特征［2］。在缺氧微环境中，肝癌细胞不仅可以改变自身的代谢方式，还可以与微环境进行物质交换，进而重塑肿瘤微环境。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成成分［3］。巨噬细胞可以分为2种表型，即经典激活型（M1） 和替代激活型 （M2）。目前研究［4］认为，M1型巨噬细胞参与肿瘤发生的早期阶段，而M2型巨噬细胞具有促进肿瘤免疫逃逸等利于肿瘤发展的特性。然而，肿瘤细胞和巨噬细胞之间的相互作用机制尚未完全阐明。目前，外泌体在肿瘤细胞与巨噬细胞之间的交互作用受到广泛关注。

外泌体是直径为30～100 nm的细胞外囊泡［5］。外泌体含有各种生物活性分子，包括DNA、mRNA和非编码RNA［6］。在缺氧条件下，肿瘤细胞可以释放富含微RNA （microRNA，miRNA） 的外泌体到肿瘤微环境中，对肿瘤微环境发挥重要调节作用。近年来，miRNA在肿瘤中的功能受到越来越多的关注。研究［7］表明，miR-432-5p 通过CXCL5抑制结肠癌细胞的侵袭和转移。还有研究［8］发现，外泌体中的miR-432-5p介导了相邻细胞群体间的耐药表型转移。然而，肿瘤细胞释放的富含miR-432-5p的外泌体是否调节了缺氧微环境中的巨噬细胞极化，目前尚不清楚。

探索肿瘤微环境中M2型巨噬细胞极化的机制，已成为肿瘤免疫治疗的重要研究方向［9］。因此，本研究探讨了巨噬细胞在缺氧微环境下的极化和机制，旨在为肝癌的免疫治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本：收集2016年6月至2020年6月于锦州医科大学附属第一医院诊断为肝细胞癌的25例患者的样本组织，所有患者术前均未行放化疗。所有患者均有完整的临床资料，本研究通过锦州医科大学附属第一医院内部审查和伦理委员会批准。

1.1.2 细胞：THP-1人单核细胞系，购自中国科学院细胞库。将THP-1细胞加入添加10%胎牛血清和1%抗生素 （青霉素和链霉素混合双抗） 的RPMI 1640培养基 （美国Gibco公司） 中后，放入37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。将3×105个THP-1细胞加入孔径为0.4 μm的滤网中，用200 nmol/L 12-肉豆蔻酸-13-酰丙酸 （美国Sigma-Aldrich公司） 处理24 h，以生成巨噬细胞。使用非接触式共培养Transwell系统 （美国Corning公司） 共培养肝癌细胞和巨噬细胞。收集肝癌细胞或肿瘤相关巨噬细胞进行后续分析。2种肝癌细胞系Huh7和HepG2，购自美国ATCC公司。Huh7和HepG2均在含有10%胎牛血清的DMEM培养基 （美国Corning公司） 中培养。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：使用RIPA裂解缓冲液 （上海碧云天生物技术有限公司） 裂解细胞。蛋白样品经12% SDS-PAGE凝胶分离后，转移到PVDF膜上。PVDF膜在室温下用5%牛血清白蛋白封闭2 h，然后与相应一抗4 ℃孵育过夜。一抗包括TSG101 （1 ∶1 000，美国Proteintech公司）、CD63 （1 ∶1 000，美国GeneTex公司）、CD81 （1 ∶1 000，中国 ABclonal公司）、ALIX（1 ∶1 000，美国CST公司）、SOSC3 （1 ∶1 000，美国CST公司）、STAT3 （1 ∶1 000，美国CST公司）、p-STAT3（1 ∶1 000，美国CST公司）、actin （1 ∶1 000，美国Proteintech公司）。TBST清洗后，使用辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2 h，TBST再次清洗后进行发光。

1.2.2 免疫荧光染色：4%甲醛固定细胞爬片15 min，使用含0.2% Triton X-100的PBS洗涤固定的细胞，然后用1%牛血清白蛋白封闭，4 ℃下与一抗孵育过夜。一抗包括CD63 （1 ∶150，美国Abcam公司）、CD163 （1 ∶150，美国Abcam公司）、CD206 （1 ∶200，美国Abcam公司）。细胞用PBS洗涤3次，然后孵育二抗，二抗包括Alexa Fluor 594羊抗兔IgG （1 ∶500，美国Life Technologies公司）、Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG （1 ∶500，美国Life Technologies公司）。再用PBS洗涤3次，用DAPI染色细胞核，Nikon A1R共聚焦显微镜 （日本尼康公司） 下观察。

1.2.3 外泌体的分离：肝癌细胞培养48 h后，收集条件培养基并以1 000g离心，使细胞沉淀。上清液用0.22 μm过滤器过滤，100 000g离心90 min，PBS 清洗1次后，再次100 000g离心90 min。使用Hitachi H7605透射电子显微镜 （日本日立公司） 观察外泌体。

1.2.4 人CD3+T细胞的分离和培养：使用FACSAria Fusion从健康个体的外周血中分离出CD3+T细胞。使用抗CD3单克隆抗体、抗CD28 单克隆抗体和转化生长因子β1刺激分选的CD3+T细胞，在RPMI 1640培养基中添加10%胎牛血清和150 IU/mL重组人白细胞介素 （interleukin，IL） -2 （中国Novoprotein公司） 进行培养。

1.2.5 流式细胞术：CD11b、CD11c、主要组织相容性复合体 （major histocompatibility complex，MHC） -Ⅱ、CD3、CD206和CD163抗体，均购自美国BD公司。在4 ℃下，肝癌细胞被分离成单细胞悬液，洗涤并在含2 mmol/L EDTA和1%牛血清白蛋白的单克隆抗体或相应的同型对照物中孵育30 min。异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体，使用Cell Quest软件 （美国BD公司）计算结果。

1.2.6 实时定量PCR （real-time quantitative PCR，qRTPCR）：使用TRIzol （美国 Thermo Scientific公司） 提取总RNA。应用PrimeScript RT试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒 （日本 TaKaRa公司） 和ABI7500系统 （美国Applied Biosystems公司）。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt方法计算基因表达水平。每个样品均重复进行3次检测。

1.2.7 免疫组织化学染色：标本蜡块做4 μm连续切片，用二甲苯和乙醇脱蜡处理。PBS洗片后，用羊血清工作液封闭30 min，分别加入抗体缺氧诱导因子 （hypoxia inducible factor，HIF） -1α （1 ∶600，美国CST公司） 和抗CD206 （1 ∶600，美国 CST公司） 37℃孵育45 min。生物素标记的二抗37 ℃孵育40 min，PBS洗片后DAB显色，苏木精复染，组织透明，树胶封片。以0.01 mol/L PBS代替一抗，作为阴性对照。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。所有实验均至少重复3次。计量资料用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧促进肝癌细胞分泌外泌体并促进M2型巨噬细胞极化

透射电镜下观察肝癌细胞培养基纯化的外泌体，外泌体大小约为80～100 nm，有双层膜结构包裹，形态和结构类似于常见的外泌体 （图1A）。检测肝癌细胞中的外泌体标志物TSG101、CD63、CD81和ALIX的表达水平，结果显示，缺氧条件下可以诱导外泌体分泌 （图1B）。缺氧诱导的外泌体可以诱导单核细胞分化为M2型巨噬细胞 （图1C、1D）。

图1 缺氧促进肝癌细胞分泌外泌体并诱导巨噬细胞M2型极化Fig.1 Hypoxia promotes exocrine secretion of hepatocellular carcinoma cells and induces M2 macrophage polarization

2.2 缺氧肝癌细胞来源外泌体改变免疫微环境

为了明确缺氧诱导的肝癌细胞外泌体是否影响免疫微环境，使用流式细胞术检测缺氧和常氧条件诱导的外泌体共培养的肝癌样本中肿瘤浸润淋巴细胞的组成。在髓样细胞中，树突状细胞的百分比降低 （图2A）。在缺氧诱导的外泌体处理后，CD3+T细胞的肿瘤浸润明显减少 （图2B）。

图2 缺氧肝癌细胞来源外泌体改变免疫微环境Fig.2 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes alter the tumor immune microenvironment

2.3 缺氧肝癌细胞来源外泌体装载的miR-432-5p被巨噬细胞摄取

为了检测缺氧下肝癌细胞来源的外泌体中是否富含miR-432-5p，使用qRT-PCR检测miR-432-5p水平。结果显示，在缺氧条件下，肝癌细胞及其分泌的外泌体中miR-432-5p表达水平更高 （图3A）。为了明确缺氧是否通过HIF-1α增加miR-432-5p水平，使用干扰小RNA沉默HIF-1α或HIF-2α的表达。结果发现，在缺氧条件下外泌体中miR-432-5p水平显著升高 （P＜ 0.05），但在HIF-1α敲低后miR-432-5p水平显著降低 （图3B）。这些结果表明，在缺氧条件下肝癌细胞来源的外泌体miR-432-5p水平取决于HIF-1α。同时检测缺氧诱导的外泌体是否可以将miR-432-5p传递至巨噬细胞中，结果表明，与常氧条件下相比，缺氧诱导的外泌体共培养的巨噬细胞中miR-432-5p水平升高 （P＜ 0.05，图3C）。

图3 缺氧肝癌细胞来源外泌体含有高水平的miR-432-5p并将其传递至巨噬细胞Fig.3 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes contain high levels of miR-432-5p and transmit it to the macrophages

2.4 缺氧肝癌细胞来源外泌体通过miR-432-5p促进M2型巨噬细胞极化

通过流式细胞术检测缺氧诱导肝癌细胞分泌的外泌体与单核细胞间的相互作用。与si-miR-432-5p处理的缺氧诱导的外泌体相比，使用缺氧诱导的外泌体处理肝癌样本后，CD206+肿瘤相关巨噬细胞上的MHC-Ⅱ类分子的表达也增加 （图4A、4B）。此外，与si-miR-432-5p处理的缺氧诱导的外泌体相比，缺氧诱导的外泌体促进了M2型巨噬细胞的形成 （图4C）。

图4 缺氧肝癌细胞来源外泌体通过miR-432-5p促进M2型巨噬细胞极化Fig.4 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes promote M2 macrophage polarization through miR-432-5p

2.5 缺氧肝癌细胞来源外泌体以HIF-1α依赖方式装载miR-432-5p

为了明确miR-432-5p与HIF-1α之间的关系，分析miR-432-5p与HIF-1α结合位点序列并构建突变质粒。荧光素酶报告实验结果证实，在肝癌细胞中共转染HIF-1α和野生型miR-432-5p导致荧光素酶活性显著降低 （P＜ 0.05），而在突变的miR-432-5p中未观察到这种现象 （图5A）。在缺氧条件下，CD63和miR-432-5p共定位 （图5B）。这些结果表明，缺氧通过HIF-1α依赖方式将miR-432-5p装载进入外泌体。

图5 缺氧肝癌细胞来源外泌体以HIF-1α依赖方式装载miR-432-5pFig.5 Hypoxia induces exosomal miR-432-5p via HIF-1α binding

2.6 缺氧肝癌细胞来源外泌体抑制肿瘤免疫活性

免疫组织化学染色显示，HIF-1α水平与巨噬细胞的存在显著相关 （图6A）。使用IL-2刺激采自健康供体血液中CFSE标记的CD3+T细胞进行体外功能实验。在共培养条件下，缺氧诱导的外泌体孵育的巨噬细胞抑制T细胞活化 （P＜ 0.05，图6B、6C）。结果提示，缺氧肝癌细胞来源外泌体抑制肿瘤免疫。

图6 缺氧肝癌细胞来源外泌体抑制肿瘤免疫活性Fig.6 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes inhibited immunological activity

2.7 miR-432-5p通过SOCS3/STAT3信号通路促进M2型巨噬细胞极化

为了探索缺氧诱导的外泌体装载的miR-432-5p促进M2型巨噬细胞极化的具体机制，通过microRNA.org-Targets （http：//www.mirdb.org/） 预测miR-432-5p与SOCS3mRNA上的结合位点 （图7A）。荧光素酶报告实验结果显示，共转染SOCS3和野生型miR-432-5p导致荧光素酶活性降低 （P＜ 0.05，图7B）。此外，miR-432-5p的过表达降低了巨噬细胞中SOCS3蛋白表达，并增加了磷酸化STAT3表达 （图7C）。这些结果表明，缺氧诱导的外泌体miR-432-5p通过SOCS3/STAT3信号通路促进M2型巨噬细胞极化。

图7 miR-432-5p通过SOCS3/STAT3信号通路促进M2型巨噬细胞极化Fig.7 miR-432-5p promotes M2 macrophage polarization through SOCS3/STAT3 signal pathway

3 讨论

缺氧是实体瘤的标志之一，与肿瘤免疫抑制有关［10］。肿瘤微环境中多种细胞均能释放外泌体并参与肿瘤的进展［11］。研究［12］表明，外泌体参与肿瘤免疫抑制微环境形成。缺氧可以诱导肿瘤细胞释放特异性外泌体，这些外泌体参与了肿瘤免疫抑制。

目前的研究［13］证实，巨噬细胞在肿瘤进展过程中发挥多种作用，尤其是M2型巨噬细胞在肿瘤免疫抑制微环境形成中的作用，使得其有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点。本文证实了缺氧促进肝癌细胞释放外泌体，并证明了缺氧诱导的肝癌细胞来源的外泌体可以诱导M2型巨噬细胞极化。多种机制参与调控M2型巨噬细胞极化，尤其是STAT3信号转导通路在巨噬细胞极化中的作用值得关注。

既往的研究［14］证实，在生理条件下STAT3信号通路的活化十分短暂，在胚胎时期以及正常组织分化过程中发挥不可或缺的作用。随着人们对STAT3信号通路认识的深入，研究［15］发现STAT3在多种肿瘤中过表达并持续激活，促进肿瘤细胞的快速增殖、分化、侵袭等恶性生物学行为。本研究证实，缺氧肝癌细胞来源外泌体中富含miR-432-5p，miR-432-5p以HIF-1α依赖方式装载进入外泌体。富含miR-432-5p外泌体释放到肿瘤微环境中后，被巨噬细胞摄取。miR-432-5p 进入到巨噬细胞后，能够与SOCS3的3’非翻译区结合，抑制其表达。SOCS3是SOCS 家族中最重要的成员之一，能够负性调控STAT3的表达。本研究通过Western blotting证实，过表达miR-432-5p抑制巨噬细胞SOCS3蛋白的表达，并促进STAT3蛋白磷酸化。

综上所述，本研究证实了缺氧微环境促进肝癌细胞释放外泌体；缺氧肝癌细胞来源外泌体通过运输miR-432-5p，靶向调节巨噬细胞中SOCS3/STAT3信号通路，最终实现诱导M2型巨噬细胞极化。肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中具有重要作用，靶向肿瘤相关巨噬细胞有望提高肿瘤化疗、免疫治疗的疗效，成为新的治疗方式。目前对肿瘤相关巨噬细胞在临床治疗中的策略了解仍非常有限，本研究为以巨噬细胞为靶点的临床治疗提供了新的实验证据。