产前地塞米松暴露对雄性子代大鼠生殖功能的影响

张园园 裴林国

地塞米松为合成类糖皮质激素，由于其能够促进胎儿肺的成熟、减少新生儿呼吸窘迫综合征的发生、降低围产儿死亡率被广泛用于早产相关妊娠疾病[1]。然而，产前地塞米松暴露对子代而言可能是把双刃剑，大量研究发现，它对孕妇和胎儿发育有明显的不利影响，潜在的后遗症包括骨关节炎、高血压、脂肪肝、肾小球硬化、抑郁症、糖尿病和不孕等[2]。本文建立孕期地塞米松暴露的大鼠模型，探讨其雄性子代成年期睾丸的睾酮合成功能及生精功能的变化；以期为阐述机制提供理论依据，为解析其对宫内环境的干扰以及子代后天生殖系统发育产生的影响提供理论和实验基础，为临床应用地塞米松治疗产前关疾病治疗策略的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

地塞米松磷酸钠注射液（郑州卓峰制药，1 mL：2 mg）；大鼠睾酮ELISA试剂盒（bio-techne公司，美国）大鼠黄体生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA试剂盒（江苏莱尔生物）；3β-羟基固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-hsd）抗体（英国abcam公司）；二抗来自武汉埃博泰克公司。逆转录PCR试剂购于大连宝生物公司。

1.2 处理动物及收集标本

SD大鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号为110322210100778134，许可证号为SCXK（京）2019-0008。大鼠适应性喂养7 d后，于每天6：00pm以雌雄2：1进行合笼，第2天上午8：00以阴道分泌物涂玻片，显微镜下见到精子者记为孕0 d。受孕大鼠以体质量由大到小的序列编号，用随机数字表随机选择一个数字并沿其下方向抄取数字，体质量为偶数的大鼠放入对照组，体质量为奇数的大鼠放入PDE组，两组分别为30只孕鼠。从怀孕第10天开始称体重，每天1次，直到孕20 d结束。在孕14～18 d期间，PDE组的怀孕大鼠鼠每天皮下注射地塞米松0.4 mg/kg，对照组则给予0.5 mL生理盐水皮下注射。怀孕20 d时，随机选取怀孕大鼠用剖宫产的方式取胎鼠，选取胎鼠数8～10只并且雄性胎鼠大于4只的怀孕大鼠纳入实验（n＝8）。每窝所雄性胎鼠血液合并成1管，分离血清。

其他的怀孕大鼠自然分娩，取符合胎鼠数8～10只并且雄性胎鼠＞4只的怀孕大鼠纳入实验。出生后1周起，每周1次称量雄性子代鼠的体重，直至第11周（n＝8）。出生后21 d子代鼠断奶，以后以正常的饮食喂养至出生后90 d。麻醉后断颈处死大鼠，颈动脉取血并分离血清，冰箱保存；打开腹腔后迅速分离右侧睾丸，利用10%的甲醛溶液固定，12 h后用石蜡包埋；其他的睾丸放置于-40℃冰柜中保存备用（动物实验流程图见图1）。

图1 动物实验流程

1.3 检测血清中激素浓度

采用大鼠睾酮的ELISA试剂盒检测雄性子代鼠血清中的各种激素浓度：一抗在室温下孵育1 h后，按照说明书加入待测的血清以及标准曲线的工作液，继续加入睾酮的结合液在室温下孵育3 h，孵育后加入底物在避光环境下继续室温孵育30 min后加入终止液，利用酶标仪分别检测450 nm和570 nm的吸光度值（A值）来计算样本值。

1.4 睾丸总RNA提取及PCR实时定量检测

睾丸组织（每窝取3个胎睾丸合并一个样，成年睾丸夹取组织30 mg），按RNA提取的说明书进行，并进行cDNA的合成和PCR扩增。然后检测睾丸组织的甾体合成急性调控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，Star）、P450侧链裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，Cyp11a1），3β-hsd的表达。以标准品相对浓度作为横坐标，各自样本Ct为纵坐标。以2-△△ct计算基因的表达水平。

1.5 睾丸荧光检测

石蜡切片脱蜡，加羊血清室温环境下封闭30 min，吸掉封闭液，加一抗4 ℃环境下孵育过夜；利用PBS洗片3次，加荧光二抗（浓度为1：400），在湿盒中37 ℃孵育1 h，淬灭剂封片溶液进行封片。采用日本尼康Eclipse Ci-S直立显微镜拍照并进行荧光计数。

1.6 精子数量检测

在盛有 5 mL Hanks液（保持37 ℃）的培养皿中剪碎附睾尾孵育30 min，进行10倍稀释，在光学显微镜100倍视野下用血细胞计数板计数4个大方格的精子数量，重复计数4次取平均值。每毫升液体中的精子数量＝4个方格中的精子平均数量×稀释倍数×104。

1.7 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件分析数据。计量资料以（±s）表示，进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDE子代雄性大鼠的体重变化

地塞米松产前暴露组雄性子代大鼠的出生体重为（5.41±0.43）g，低于对照组的（6.00±0.25）g，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。这种趋势一直持续至出生后3周，从出生后第4周开始，地塞米松产前暴露组雄性子代大鼠的体重追赶上对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 地塞米松产前暴露组与对照组PDE子代雄性大鼠的体重变化比较（g，±s）

表1 地塞米松产前暴露组与对照组PDE子代雄性大鼠的体重变化比较（g，±s）

组别出生0周出生1周出生2周出生3周出生4周出生5周对照组（n＝8）6.00±0.2511.82±0.4623.32±1.5735.14±2.8069.70±5.80116.14±9.46地塞米松产前暴露组（n＝8）5.41±0.4310.66±1.0320.57±2.6631.12±3.3163.52±6.80110.04±11.37 t值3.5403.1002.6802.7902.0701.240 P值0.0030.0100.0190.0130.0550.230组别出生6周出生7周出生8周出生9周出生10周出生11周对照组（n＝8）148.89±10.66190.93±16.07241.47±16.46279.62±18.79315.64±24.89342.92±27.86地塞米松产前暴露组（n＝8）141.57±8.27184.49±12.56235.47±17.12273.19±19.65319.61±23.52348.29±21.95 t值1.6300.950 0.7600.710 -0.350-0.450 P值0.1200.3600.4600.4900.7300.660

2.2 PDE子代雄性胎鼠血清的睾酮浓度和睾丸间质细胞的数量

与对照组相比，地塞米松产前暴露组的雄性胎鼠血清睾酮明显降低（P＜0.05），胎睾丸间质细胞的数量也降低（P＜0.05），见表2。

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睾酮浓度和睾丸组织间质细胞数量（±s）

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睾酮浓度和睾丸组织间质细胞数量（±s）

组别胎血睾酮浓度（n＝8，ng/mL）3β-hsd阳性细胞数（n＝5，×103）对照组1.78±0.96146.72±15.56地塞米松产前暴露组0.99±0.25123.34±7.95 t值2.2522.994 P值＜0.05＜0.05

2.3 PDE子代雄性胎鼠睾丸甾体激素合成酶的基因表达

与对照组相比，地塞米松产前暴露组雄性胎儿大鼠睾丸组织的Star、Cyp11a1、3β-hsd的基因表达水平均降低，见表3。

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睾丸组织中甾体激素合成酶的基因表达（±s）

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睾丸组织中甾体激素合成酶的基因表达（±s）

组别指标表达量t值 P值对照组（n＝8）Star0.68±0.212.453 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）0.36±0.08对照组（n＝8）Cyp11a10.56±0.129.302 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）0.16±0.02对照组（n＝8）3β-hsd1.63±0.354.174 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）0.79±0.45

2.4 PDE子代雄性大鼠的血清睾酮浓度及睾丸间质细胞数量

与对照组相比，地塞米松产前暴露组的雄性成年大鼠的血清睾酮浓度降低（P＜0.01），血清黄体生成素浓度升高（P＜0.05），血清黄体生成素与睾酮的比值升高（P＜0.05）。出生后90 d的雄性大鼠的睾丸间质细胞的数量为（18.53±3.22）个，低于对照组的（42.00±5.49）个，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4。

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睾酮浓度和睾丸组织间质细胞的数量（±s）

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睾酮浓度和睾丸组织间质细胞的数量（±s）

组别表达量t值 P值对照组（n＝8）成年雄性大鼠血睾酮浓度（g/mL）3.56±0.2510.586 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）1.98±0.34对照组（n＝8）成年雄性大鼠血黄体生成素浓度（ng/mL）2.78±0.2611.445 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）4.48±0.33对照组（n＝8）黄体生成素：睾酮0.82±0.246.552＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）2.23±0.56对照组（n＝5）3β-hsd+细胞数量（×106）42.00±5.498.251 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝5）18.53±3.22

2.5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睾丸甾体激素合成酶的基因表达

与对照组相比，地塞米松产前暴露组雄性成年大鼠睾丸Star和3β-hsd的基因表达水平降低（P＜0.05），Cyp11a1的表达水平无变化，见表5。

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睾丸组织甾体激素合成酶的基因表达（±s）

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睾丸组织甾体激素合成酶的基因表达（±s）

组别指标表达量t值 P值对照组（n＝8）Star6.48±0.2638.592 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）1.92±0.21对照组（n＝8）Cyp11a18.98±0.232.045 2 ＞0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）8.14±0.36对照组（n＝8）3β-hsd10.25±2.244.851 ＜0.05地塞米松产前暴露组（n＝8）5.19±1.92

2.6 PDE子代雄性大鼠的附睾精子参数

结果研究表明，与对照组相比，地塞米松产前地塞米松产前暴露组雄性成年大鼠附睾尾部精子数量为（24.21±8.79）个，低于对照组的（79.24±15.23）个，差异有统计学意义（t＝6.998，P＜0.01）。

3 讨论

据统计，全球的早产儿出生率占总新生儿出生率的5%，而早产仍然是新生儿死亡的主要原因[3]。目前，糖皮质激素依然是改善早产儿结局的最重要的治疗手段之一，针对孕24～34周并有早产风险的妇女，临床建议使用糖皮质激素治疗[4]。有研究发现，在大鼠中，产前接触合成类固醇地塞米松（很容易穿过胎盘）或抑制Ⅱ型11β-羟基类固醇脱氢酶的物质，出生体质量会降低[5-7]。本研究也发现，地塞米松产前暴露组雄性子代大鼠的出生体质量低于对照组，这种趋势一直持续至出生后3周，从出生后第4周开始雄性子代大鼠的体质量追赶上对照组。

睾酮是促进胎儿包括生殖器的发育、睾丸下降等器官向雄性方向发育的主要激素[8]。研究发现，睾丸间质细胞是分泌睾酮的主要细胞，大鼠在胎儿期时体内的睾酮主要由胎睾丸间质细胞在系列甾体合成酶催化下产生的，而睾丸间质细胞的分布以及数量变化能够影响睾酮的产量[9-10]。本文发现，地塞米松产前暴露组的胎鼠血清中睾酮浓度降低，同时胎睾丸间质细胞的数量降低并伴随甾体合成酶Star和3β-hsd表达水平的降低。以上结果显示，宫内时期，产前地塞米松暴露的子代大鼠血中睾酮浓度下降与睾丸间质细胞数量降低和甾体合成酶Star和3β-hsd的基因表达降低有关。

研究发现，宫内时期发育阶段雄激素水平缺乏能够导致成年后生殖系统疾病发生风险性增加[11]，并且雄激素能够促进精子的发生和发育[12]。在成年时期，睾丸间质细胞睾酮合成的过程主要是由下丘脑-垂体轴分泌的黄体生成素调节有关。本研究中发现，产前地塞米松暴露的90 d子代雄性大鼠出现了血睾酮浓度的下降，但是血中黄体生成素的浓度却反馈性的升高；此外，睾丸间质细胞数量减少、甾体合成酶Star和3β-hsd的表达水平下降90 d子代大鼠的附睾精子数量减少。因此，产前地塞米松暴露的成年后子代大鼠精子数量减少可能与血中睾酮浓度降低相关。

研究表明，Star参与了类固醇激素的原料胆固醇由线粒体外膜向内膜的转运，它是睾酮合成过程中的重要限速步骤[13-14]。本文发现，甾体合成酶Star和3β-hsd的基因表达在宫内和出生后成年期的大鼠出现了一致性的表达降低，而3β-hsd不被认为是睾酮合成的限速步骤[15-16]。因此，产前地塞米松暴露所致的Star的表达降低可能是子代大鼠睾酮水平持续降低的主要机制之一。

综上所述，产前地塞米松暴露能够导致子代大鼠在宫内出现血清睾酮浓度降低，并能够延续到出生后成年期，同时还伴随精子数量减少，这种现象的发生可能与宫内产前地塞米松暴露所致的甾体酶Star的基因表达降低有关。